基于线粒体D-loop 区序列的中华鳖不同群体遗传差异分析

李璐，谭舜，王彪，徐建荣，韩晓磊

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

线粒体DNA 是共价闭合的双链DNA 分子，核酸组成和序列较保守，基因排列的顺序稳定而紧密，无单拷贝和重组，含有丰富的进化信息，具有长度短、含量丰富、母性遗传和进化速度快等特点，已成为研究动物遗传分化及起源进化的理想手段[1-5]。通常，线粒体D-loop 区是线粒体基因组中进化速度最快、多态性最为丰富的部分，该区的变异广泛用于鱼类亲缘关系、种属分类、遗传分化和遗传多样性等研究[6-8]。

中华鳖Trionyx sinensis（俗称甲鱼、团鱼、王八等），分布广泛，除西藏和青海以外的其它各省均有发现，长江流域和华南地区分布较多[9,10]。江苏省境内有两大淡水湖泊，即长江水系的太湖（中国第三大淡水湖）和淮河水系的洪泽湖（中国第四大淡水湖）中华鳖是传统特色渔业资源。近年来，受自然环境和人为因素的影响，导致中华鳖两个相对独立的地理群体，即太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体的自然资源均急剧减少，种质资源也受到了严重威胁。主要分布于长江中下游的太湖花鳖是中华鳖的地方特色品种，与普通中华鳖体色差异较大，即背上有对称的黑色小圆花点，野生环境中身体油绿，腹部有明显灰黑色块状花斑；太湖花鳖群体面临外界环境的压力，种群资源日益减少。目前，中华鳖种质资源，特别是其亚种分类还没有明确的论断，不同的地理群体的区分也不甚明了，其中太湖花鳖的研究更是鲜有报道[11]。本文利用线粒体D-loop 区序列比对技术分析了中华鳖不同群体的遗传多样性，判断其群体间是否有遗传分化，为中华鳖不同群体间的种质鉴定和分类提供一定的理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

2018 年5—11 月期间，在太湖流域苏州太仓、常州武进和洪泽湖流域宿迁泗洪地区分别采集了太湖花鳖（简称H，野生群体，图1）30 尾、太湖鳖（简称T，野生群体，图1）19 尾和洪泽湖鳖（简称Z，野生群体，图1）20 尾。将这三个群体中华鳖腿部肌肉样品置于无水乙醇中，-20℃保存，用于D-loop区序列分析。

1.2 方法

DNA 提取：中华鳖基因组DNA 的提取参照韩晓磊等[12]的方法。用分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000）测定基因组DNA 的浓度；用凝胶成相系统（UVP Biospectrum 410）检测DNA 的完整性，检测合格的DNA 置-20℃保存备用。

PCR 扩增、测序及分析：根据GenBank 上中华鳖线粒体基因组序列（AY687385.1）设计用于扩增D-loop 区的2 对引物（表1），送苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，用去离子双蒸水将其溶解至浓度为20 μmol/L。PCR 扩增反应体积为25 μL，含模板基因组DNA 100 ng、10×Buffer 2.5 μL、2.5mol/L MgCl22.0 μL、dNTP 1.5 μL、上下游引物各1 μL、1 U Taq DNA 聚合酶，加无菌水补足。PCR 反应的循环参数为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，55.3 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化后送至苏州金唯智生物科技有限公司直接进行序列测定。为保证序列的准确性，序列经过正反两次重复测定。所获得的序列经校对后，采用DNAMAN 7.0 软件进行序列比对；利用DNAsp 4.0 软件统计单倍型及变异位点、计算单倍型多样性（Hd）及核苷酸多样性（π），评价群体遗传多样性水平；用MEGA 5.1 软件计算群间和群内的遗传距离，分析碱基组成及核苷酸位点的替换数。

表1 中华鳖线粒体D-loop 区扩增引物及序列Tab.1 Primer of amplification and the sequence in wild Chinese soft-shelled turtle（T.sinensis）

2 结果与分析

2.1 中华鳖线粒体D-loop 区序列分析

将获得的序列与GenBank 中序列号为AY687385.1 的中华鳖线粒体DNA 序列进行同源比对，证实测得的序列位于中华鳖线粒体D-loop 区范围之内，片段长度为513～518 bp，与设计产物515 bp 大小相符。于GenBank 上进行Blast 比对，分析结果与中华鳖已提交线粒体DNA 序列（NC_006132.1和AY962573.1）相应基因片段的同源性达95%以上，说明测得序列的准确性。

经软件分析，获得的测序片段之间同源性为95.76%，存在个别位点的核苷酸的变异共计12 个，总变异率为2.43%，平均转颠换比（Ts/Tv）为2.3。中华鳖三个群体D-loop 区的碱基组成分析显示：A、T、C 和G 碱基平均含量分别为26.9%、33.9%、30.3%和8.9%，其中A+T 含量（60.8%）明显高于G+C 含量（39.2%），表现出明显的反G 偏倚。

2.2 中华鳖群体遗传多样性分析

利用DNAsp 软件计算了中华鳖69 个个体线粒体D-loop 序列的遗传多样性指数，三个群体的单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（π）数值均是洪泽湖鳖群体＞太湖花鳖群体＞太湖鳖群体（表2）；三个群体间单倍型多样度（Hd）为0.381，核苷酸多样性（π）为0.0043。

表2 中华鳖群体遗传多样性指数分析Tab.2 Genetic diversity indices of three different populations of wild Chinese soft-shelled turtle（T.sinensis）

2.3 中华鳖群体差异分析

DNAMAN 软件的序列比对结果发现，太湖花鳖群体、太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体群内序列同源性分为99.23%、99.14%和98.95%；三个群体间序列同源性为95.76%。通过MGEA 软件分析三个群体的遗传距离发现，太湖花鳖群体与洪泽湖鳖群体遗传距离较大，太湖鳖群体与洪泽湖鳖群体遗传距离较小，三个群体间遗传距离为0.0479（表3）。MEGA 软件建立的NJ 分子系统树呈现出清晰的两大群体，太湖花鳖群体单独聚类；太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体形成聚类，但在类群内可见两个群体有一定的分化趋异（图2）。

表3 中华鳖群间遗传距离分析Tab.3 The genetic distance among three different populations of wild Chinese soft-shelled turtle（T.sinensis）

3 讨论

3.1 中华鳖群体遗传分化分析

线粒体DNA 进化速度快，种群间的遗传差异容易测出，已成为种内和种间鉴定的良好标记。群体间的遗传距离是衡量群体遗传分化的重要指标[13]。根井正利[14]利用遗传距离数值定量估计了物种的不同分类单位间的遗传分化水平，指出种群间遗传距离值的范围是0～0.05，亚种间是0.02～0.2。本研究中，三个中华鳖群体间的遗传距离均在0.05 以下，说明三个群体之间的遗传分化还处于群间水平；而太湖花鳖群体与太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体之间的遗传距离均高于0.02，表明其群体间的遗产分化已达亚种间水平。MGEA 软件聚类分析发现，中华鳖三个群体明显分为两支，太湖花鳖群体单独聚类，太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体混合聚类，但也发现太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体有一定的分化趋异。

太湖花鳖属于中华鳖的地方特色品种，与中华鳖常规品种在形态上存在较大差异（图1），本文则是从基因层面对此表型差异，即遗传分化已经达到亚种间水平予以了揭示。这也与韩晓磊等[15]基于AFLP 分子标记技术对太湖流域中华鳖花鳖群体和普通群体的研究结果相一致。当然，太湖花鳖群体与太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体之间分化水平的确定，还需要更多方面的研究予以论证。

Levinton 等[16]认为不同地区的生境差异（温度、盐度和洋流等）是产生和保持地理群体间遗传结构差异的重要因素。太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体分属于太湖流域和淮河流域，然而太湖和洪泽湖之间无明显的地理屏障隔离，其间有水系相连通，加之中华鳖活动能力较强且水陆兼可，致使太湖鳖群体和洪泽湖鳖群体之间虽然表现了一定的遗传分化趋势，但其分化水平不高，也仅限于不同群体之间的遗传差异。

3.2 中华鳖群体的遗传多样性分析

生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的重要依据，是物种适应多变的环境，维持长期生存和进化的遗传基础[17]。应用线粒体DNA 测序技术研究物种的遗传多样性时，核苷酸多样性（π）是衡量一个群体线粒体DNA 的遗传变异程度的重要指标[18]。Nei 等[19]认为，群体内两个随机选取的线粒体DNA 序列间核苷酸多样性（π）值越小，群体的遗传多样性越低。Lan 等[20]也认为，当π 值在0.0015～0.0047 时，群体的遗传多样性较低。本研究中，中华鳖洪泽湖群体、太湖花鳖群体和太湖鳖群体的核苷酸多样性（π）分别为0.0046、0.0031 和0.0014，π 值均小于0.0047，说明以上三个中华鳖群体的遗传多样性水平较低，且基本处于同一水平。三个中华鳖群体的群内和群间的基因序列同源性结果支持了以上结论。

中华鳖向来是我国名贵的食物和药材，随着近代中华鳖人工养殖业发展迅速[21]，造成野生甲鱼被大量捕获用于食用与养殖，导致了自然种群混杂，群体多样性不断降低，中华鳖种质严重退化，野外个体数量不断减少[22]。世界自然保护联盟（IUCN）日前发布的最新版全球濒危物种红色名录，已将中华鳖列入濒危物种名单[23]。基于以上因素必然导致中华鳖野外种群形成小群体，加速了繁殖群体的日益缩小，增加了近交频率的发生，容易出现小群体效应，最终造成三个中华鳖群体遗传多样性处于较低水平，这也从基因水平说明了其处于濒危状态的现状，这也要求我们必须重视并开展对中华鳖野生群体遗传多样性的保护工作。