C5orf34在非小细胞肺癌中的表达及预后分析

徐克明，冉安鹏，何 丹

（新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科一病区，乌鲁木齐830011）

肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要病种之一，在发病率和死亡率方面，NSCLC占肺癌病例总数的80%[1]。其中肺腺癌是NSCLC最常见的组织学类型[2]。影响NSCLC预后的因素较多且机制较复杂[3]。虽然肿瘤综合治疗使患者预后有所改善，但仍不尽如人意[4]。本研究的前期研究阶段利用2017年TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）的肺腺癌转录组测序表达数据，筛选出5号染色体开放阅读框架34（chromosome 5 open reading frame 34，C5orf34）是影响肺腺癌患者预后的癌基因，并在细胞水平证实了C5orf34具有促进人肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力[5]。应用免疫组织化学从蛋白质水平方面对NSCLC患者的病理组织进行分子分期不仅提升了分期的精准性，同时也增强了个体化治疗的可行性。由于C5orf34在人类身上的确切功能还不为人所知，因此有必要进一步验证C5orf34蛋白在肺腺癌组织中的表达情况和对患者预后的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择新疆医科大学附属肿瘤医院2014年1月1日-2016年12月31日期 间，接受 标 准肺癌根治术(肺叶切除+系统性纵隔淋巴结清扫)的非小细胞肺癌患者341例，并进行电话随访。纳入标准：未接受过术前放化疗；有癌组织和癌旁组织病理标本的患者。排除标准：失访病例；肺部肿瘤为继发恶性肿瘤；已证实出现远处转移者。符合上述标准的患者共135例。其中平均年龄（65±5.43）岁，男性84例，女性51例。Ⅰ期患者48例，Ⅱ期+Ⅲ期87例（UICC2009版），鳞癌55例，腺癌80例，见表1。

1.2 免疫组织化学染色及评分标准

1.2.1 免疫组织化学染色取非小细胞肺癌患者的肿瘤及正常组织，分别制成5μm的白片。脱蜡复水后，3%H2O2处理20 min，抗原恢复10 min。血清封闭液室温封闭30 min后，涂抗C5orf34抗体（1:200稀释;bs-15202R;Bioss）在4°C孵育过夜。然后在37°C用二抗孵育1 h。洗涤后，这些切片用链霉亲和素-生物复合物（strept avidin-biotin complex,SABC）制剂处理，并进行3-二氨基联苯胺（diaminobezidin 3,DAB）着色。苏木精(Sigma)染色，脱水，二甲苯清除，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.2.2 免疫组织化学评估采用组织化学（H-score）评分标准[6]，由2名病理科高级职称医师独立阅片，取平均值。从每张切片中随机选取5个高倍镜(×400)场，共计数100个细胞。染色强度评分与阳性肿瘤细胞百分率相乘，得到反映相对蛋白表达水平的半定量H-score评分。染色强度评分:0，阴性(未染色);1，弱阳性(淡黄色染色);2，阳性(深黄色染色);3，强阳性(棕色染色)。阳性肿瘤细胞百分比:0，无阳性肿瘤细胞;0.1,1～9%;0.5，10～50%；1.0，＞50%。C5orf34的表达情况判定以癌组织中H-score中位评分为界，大于中位数者认定为C5orf34表达阳性，反之为表达阴性。

1.3 术后随访135例NSCLC患者术后采取电话随访形式。随访时间自手术之日起，至2019年12月1日。终点事件为肿瘤复发和患者死亡。评价指标为患者1、2、3年的DFS。

1.4 统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计分析，秩和检验比较C5orf34在癌组织和癌旁组织表达差异。一般临床资料的两分类变量比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法中Log Rank检验。多因素分析采用Cox回归模型向前法。

2 结果

2.1 癌组织中C5orf34的表达显著高于癌旁组织135例NSCLC患者C5orf34 H-score评分：＜0.5分为98例；0.5～1.5分为35例，＞1.5分为2例，如图1A所示。C5orf34在鳞癌和腺癌组织阳性结果，C5orf34染色定位于细胞浆内，见图1B。肿瘤中的C5orf34的评分显著高于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.001），图1C。

2.2 C5orf34与组织学分级和肿瘤（T）分期的关系肿瘤组织中C5orf34的阳性率与病理分期、T分期有关。肿瘤病理分期（pTNM）II～III期以及T2～T4的患者中C5orf34的阳性率显著高于病理分期I期以及T1的患者（P=0.012，0.002，0.012）。肿瘤组织中C5orf34的表达率与年龄、性别、病理类型、组织学分级、淋巴结（N）分期和吸烟差异均无统计学意义，见表1。

表1 135例NSCLC患者肿瘤组织C5orf34表达与临床病理特征的关系

2.3 C5orf34是影响非小细胞肺癌根治手术患者DFS的重要因素C5orf34阳性的患者1、2、3年的DFS率分别为57.00%、41.20%和23.20%，中位DFS时间为18.60（8.18～29.02）月；C5orf34阴性的患者1、2、3年DFS率为89.40%、62.60%和47.40%，中位DFS时间为33.77（17.20～50.34）月，见表2。Kaplan-Meier生存分析显示C5orf34阳性患者的DFS显著低于C5orf34阴性患者（P=0.003），见图1D。此外，COX回归多因素生存分析结果显示：C5orf34、pTNM是影响患者DFS的重要因素，见表3。而且在亚组分析，肺鳞癌和腺癌C5orf34阳性患者的3年DFS率均显著低于阴性患者（P=0.039，P=0.016），见表4。Ⅱ+Ⅲ分期（P=0.006）、N1+2(P=0,032)，C5orf34阳性的3年DFS率显著低于阴性患者（P=0.006），见表5～7。

表2肿瘤组织中C5orf34表达对NSCLC患者预后分析

表3 NSCLC患者COX回归多因素分析

表4肿瘤C5orf34表达对不同病理类型患者的预后分析

图1 C5orf34在NSCLC患者肿瘤和正常肺组织中的表达

表5肿瘤C5orf34表达对不同病理分期的患者预后分析

表6肿瘤C5orf34表达对不同淋巴结分期的患者预后分析

表7肿瘤C5orf34表达对不同肿瘤大小的患者预后分析

3 讨论

C5orf34是一种由C5orf34基因编码的蛋白质。C5orf34在哺乳动物、鸟类和爬行动物中是保守的。C5orf34蛋白质包含两个哺乳动物的保守域：DUF 4520和DUF 4524。C5orf34由638个氨基酸组成，分子量为72.7kDa[7]。根据人类蛋白质图谱显示，C5orf34在人类中在胃、小肠、睾丸、骨骼肌和心肌组织中表达最丰富，在正常肺组织中低表达[8]。目前C5orf34在人类身上的确切功能还不为人所知，有文献报道，C5orf34基因可能与妊娠期糖尿病有关[9]。根据蛋白结构推测其可能与激酶相关的细胞功能有关，可能涉及基因调控和细胞增殖[10]。

Zhang等[11]在Ia期肺腺癌患者中选择4个预后较好的腺泡型肺腺癌和4个预后较差的实体型肺腺癌进行基因表达谱的芯片分析，筛选出C5orf34是表达上调差异基因之一；之后其在TCGA数据库中验证，结果发现C5orf34是影响实体型肺腺癌患者预后的差异基因之一，而C5orf34对腺泡型肺腺癌的预后无影响。这提示C5orf34可能在肺腺癌的不同亚型间表达存在差异从而影响预后。以上只是大数据推测，并未真正验证C5orf34的基因功能。本课题前期证实了干扰C5orf34基因后能降低人肺腺癌细胞A549和SPC-A1的增殖、侵袭和迁移能力[5]。此次通过免疫组织化学分析进一步验证C5orf34在肿瘤组织中的表达显著高于正常肺组织。C5orf34与T、病理分期呈显著正相关性(P＜0.05)，这与TCGA数据库中临床分析结果基本一致。此外肺鳞癌和腺癌中C5orf34的阳性率（22.2%和31.9%）差异并无统计学意义，这提示C5orf34的表达可能与NSCLC的病理类型无关。本研究的预后分析结果发现C5orf34并不影响I期患者预后。但是对于II～III期患者，C5orf34阳性的DFS显著低于阴性患者，这一现象在T分期和G2～3级的亚组分析中结果均一致。这提示C5orf34可能与肿瘤的发展分化密切相关。以上临床分析结果与该基因细胞功能表型结果相一致，即：促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

综上所述，本研究在蛋白水平验证了C5orf34是影响非小细胞肺癌预后的重要因素，这与TCGA数据库的分析结果相一致，并发现对于进展期非小细胞肺癌C5orf34的预后临床意义更大。上述结果是C5orf34基因功能研究在临床方面的进一步补充，其相关信号通路机制尚不清楚，仍需深入研究。