QuEChERS-UPLC-MS/MS法同时测定青虾中27种兽药残留

李文杰 倪建秀 丁春晖 陈涛 陈桂芳

摘要 [目的]建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同位素内标法同时测定青虾中磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、酰胺醇类4大类27种兽药残留量的检测方法。[方法]青虾样品经86%（V/V）酸化乙腈（3%甲酸）-水溶液（含0.1 mol/L EDTA）提取后，提取液经分散固相萃取法净化，以UPLC-MS/MS测定，内标法定量。[结果]27种兽药在各自线性范围内呈良好的线性关系（R2≥0.99），磺胺类、氟喹诺酮类、酰胺醇类、四环素类的定量限分别为2.0、2.0、1.0、50.0 μg/kg，回收率在70.1%～110.0%，相对标准偏差（RSD）在0.2%～9.8%。[结论]该方法前处理简单、准确、对环境友好，适用于青虾中兽药残留的高通量快速检测分析。

关键词 QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法;同位素内标法;兽药残留;青虾

中图分类号 TS254.7  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）24-0197-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.048

Simultaneous Determination of 27 Veterinary Drug Residues in Freshwater Shrimp by QuEChERS-UPLC-MS/MS

LI Wen-jie，NI Jian-xiu，DING Chun-hui et al （Quality Inspection Institute of Agricultural Products of Nanjing，Nanjing，Jiangsu 210036）

Abstract [Objective]To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） with isotope-labelled internal standard method，which was used to determine multiclass veterinary drugs residues simultaneously including sulfonamides，fluoroquinolones，tetracyclines and amphenicols in freshwater shrimp.[Method] The samples were extracted with 86% （V/V）acidified acetonitrile（3% formic acid）-water（containing 0.1 mol/L EDTA），then the extract was purified by dispersive solid phase extraction （DPSE）.The samples were determined by UPLC-MS/MS and quantified by internal standard method.[Result]27 kinds of veterinary drugs showed good linear relationship in their respective linear ranges （R2≥0.99）.The limits of quantification of sulfonamides，fluoroquinolones，amide alcohols and tetracyclines were 2.0，2.0，1.0，50.0 μg/kg，respectively.The recovery rates were 70.1%-110.0%.The relative standard deviations were 0.2%-9.8%.[Conclusion]The method is simple，accurate and environment-friendly，which is suitable for high-throughput rapid detection and analysis of veterinary drug residues in freshwater shrimp.

Key words QuEChERS-UPLC-MS/MS;Isotope internal standard method;Veterinary drug residue;Freshwater shrimp

基金项目

2018年度江苏省第五期“333工程”科研项目（BRA2018121）。

作者简介 李文杰（1980—）， 男， 江苏宜兴人，高级工程师，硕士，从事农产品质量安全检测与风险评估研究。通信作者，高级工程师，硕士，从事农产品质量安全检测工作。

收稿日期 2021-04-29

青虾，学名日本沼虾（Macrobrachium nipponense），是南京水产养殖的特色产业，养殖面积达4 666.67 hm2，产值超10亿元，规模仅次于螃蟹，尤其是2019年开始南京大面积推广养殖生长速度更快、抗病抗逆能力更强的新品种“太湖2号”，在科技创新、净化水环境、富民增收等方面發挥着重要作用[1]。近年来养殖者反映青虾出现散发性死亡[2]，需要合理使用兽药，防治消化道细菌感染等疾病[3]。因此，兽药残留成为青虾质量安全的一个关注热点。

目前，国内外动物性产品中兽药残留检测的前处理方法主要有固相萃取法、QuEChERS法、基质固相分散萃取法等[4-6]，检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法[7-8]，超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）因具有高灵敏度、高选择性的优势已被广泛用于兽药多残留分析[9]，因此在青虾样品中同时检测磺胺类12种、氟喹诺酮类8种、酰胺醇类3种、四环素类4种计27种兽药多残留测定具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试材

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪（Waters公司）;QTRAP 5500质谱仪（SCIEX公司）;BP211D电子天平（赛多利斯公司）;KS501振荡器（IKA公司）;AllegraX-30R台式高速冷冻离心机（贝克曼公司）;MS3涡旋混合器（IKA公司）;MV5全自动平行浓缩仪（莱伯泰科公司）。27种兽药标准品和10种同位素内标（德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度>99.8%）;乙腈为色谱纯（TEDIA公司）;乙酸铵为色谱纯（美国Sigma-aldrich公司）;40～63 μm PSA、40～63 μm C18净化剂、甲酸，均为色谱纯，上海安谱实验科技有限公司;乙二胺四乙酸（EDTA）、无水硫酸钠，均为分析纯，南京化学试剂股份有限公司;实验室用水为Milli-Q超纯水。

青虾样品为南京市地产例行监测样品。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 兽药标准储备液。

1.2.1.1 标准储备液。分别精密称取各兽药标准品适量，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度均为100 μg/mL的标准储备液，于-20  ℃保存。

1.2.1.2 内标储备液。分别精密称取各兽药内标适量，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度均为100 μg/mL的内标储备液，于-20  ℃保存。

1.2.2 兽药混合标准使用液。

1.2.2.1 混合标准使用液。分别吸取适量兽药标准储备液（100 μg/mL），用甲醇配制成中间液，再分别吸取2.00 mL磺胺类标准中间液（2.0 μg/mL）、2.00 mL氟喹诺酮类标准中间液（2.0 μg/mL）、4.00 mL酰胺醇类标准中间液（1.0 μg/mL）、10.00 mL四环素类标准中间液（10 μg/mL）置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，置于-20  ℃冰箱保存。磺胺类、氟喹诺酮类、酰胺醇类和四环素类兽药的质量浓度分别为80、80、40和2 000 μg/L。

1.2.2.2 混合内标使用液。分别吸取5.00 mL磺胺类、氟喹诺酮类、酰胺醇类内标中间液（10 μg/mL）和5.00 mL四环素类内标储备液（100 μg/mL）置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，置于-20  ℃冰箱保存，内标工作液的质量浓度磺胺类、氟喹诺酮类、酰胺醇类均为1.0 μg/L，四环素类为10.0 μg/L。

1.2.3 兽药混合标准工作曲线溶液。吸取适量27种兽药混合标准使用液和混合内标使用液，用初始流动相稀释，磺胺类和氟喹诺酮类质量浓度为20～400 μg/L，四环素类质量浓度为50～800 μg/L，酰胺醇类质量浓度为1～200 μg/L，于4 ℃条件保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 采样和试样制备。抽取有代表性的青虾样品，至少取10尾清洗后[10]，去虾头、虾皮，得到整条虾肉绞碎混合均匀备用，试样量为400 g。

1.3.2 提取。

称取2.00 g试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 μL混合内标工作液，加入1.0 mL水和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，混匀1 min后再加入8.6 mL 3%酸化乙腈，于涡旋混合器上混合1 min后振荡20 min，以4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，取上清液。

1.3.3 净化。

取5.0 mL上清液，加入DSPE混合净化剂（50 mg PSA+150 mg C18+900 mg无水硫酸钠），涡旋30 s后，4 000 r/min离心10 mim，取上清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4 液相色谱-串联质谱条件

1.4.1 液相色谱条件。色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），前端连接ACQUITY UPLC CSH保护柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）。流动相A为2 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序为0.1～2.0 min，3%B～15%B;2.0～5.0 min，15%B～22%B;5.0～11.0 min，22%B～25%B;11.0～12.0 min，25%B～30%B;12.0～13.0 min，30%B～35%B;13.0～13.5 min，35%B～80%B;13.5～16.0 min，80%B～90%B;16.0～16.1 min，90%B～3%B;16.1～18.0 min维持3%B。流速0.3 mL/min，进样量5 μL，流路在1.0～16.0 min進入质谱，在1.0 min之前和16.0 min之后切向废液，柱温为40 ℃。

1.4.2 质谱条件。

电喷雾离子源ESI;1.0～2.5、5～16 min进行正离子模式扫描，2.5～5.0 min进行负离子模式扫描（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考-D3、氯霉素-D5）;雾化气压力为413.7 kPa，气帘气压力为206.8 kPa，辅助加热气压力为344.7 kPa，碰撞气设置为Medium，以上4种气体均为氮气;离子源温度为600  ℃;正离子化电压为4 500 V;负离子化电压为-4 500 V;多反应监测（MRM）采集模式;其他参数见表1。

2 结果与分析

2.1 试验条件的优化

2.1.1 提取剂的优化。

兽药多残留分析所选用的溶剂包括乙腈-水-缓冲液、乙腈-水-酸、甲醇-水-酸等溶剂，甲醇提取时会带入更多的极性基质干扰物，且蛋白沉淀松散，增加后续净化难度[11]。因EDTA是一种良好的螯合剂，不仅能够有效分散基质，还能竞争性地去除基质中存在的金属离子，使四环素和部分氟喹诺酮类化合物游离出来，在EDTA与无机离子螯合释放出四环素后，利用一些酸化剂来调节体系的pH可以更进一步地促进四环素的提取效率[12]，另外，EDTA的弱电离性也能促进体系的电离平衡，抑制溶液中的酸性离子对磺胺类化合物的冲击[13]。因酸度过量时，大部分磺胺类待测物都会发生一定程度的损失，降低提取效率[12-13]。故该试验选择先加入1.0 mL水和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，混匀1 min后再加入8.6 mL甲酸乙腈混匀1 min，250 r/min 振荡20 min提取，4种提取试剂组成见表2，比较不同提取溶剂对兽药回收率的影响。

通过单因素方差分析，结果显示，在α=0.05水平上，四环素类差异显著，不同提取溶剂回收率见图1，提取试剂3回收率在70.1%～119.0%，而磺胺类、氟喹诺酮类、酰胺醇类差异不显著，回收率分别为45.0%～120.0%、40.0%～162.5%、72.0%～109.5%，因此，该方法最终选择提取试剂3，即86%（V/V）酸化乙腈（3%甲酸）-水溶液（含0.1 mol/L EDTA）。

2.1.2 净化方法的选择及条件的优化。该研究比較了MAS-Q NANO、DSPE混合净化剂（PSA+C18+无水硫酸钠）和Cleanert LipoNo这3种净化试剂对去除色素和降低基质干扰的效果，结果显示，采用LipoNo净化后目标分析物干扰峰较多，且上机液颜色较深，而DSPE混合净化剂在色素和基质干扰方面效果良好，NANO和LipoNo最佳提取净化的条件还有待进一步研究。

2.1.3 定性与定量方法的选择。

在相同的质谱条件下，将样品质谱图与基质加标质谱图进行对照，样品保留时间与基质加标阳性样品保留时间相对偏差在5%以内，且检测的离子相对丰度与浓度相当的校正标准品相对丰度一致。基峰与次强碎片离子丰度比符合相关要求，最终确定样品中的兽药残留。因同位素内标法更适用于测定药物中微量组分或杂质的含量，且能避免试验前处理操作中的目标成分丢失造成的定量不准确，降低基质效应，该研究选择了内标法定量，各目标物定量对应的氘代化合物见表3。

2.2 兽药基质加标质谱图 按“1.4”色谱质谱条件，分别对27种兽药加标样品进行测定，27种兽药50 ng/mL基质加标质谱图如图2所示。

2.3 方法的线性范围和检出限

以标准系列峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度进行线性回归分析，以10倍信噪比计算定量限（LOQ）。结果表明，27种兽药在各自线性范围内呈良好的线性关系，且决定系数（R2）大于0.99（表1），磺胺类、氟喹诺酮类、酰胺醇类和四环素类的LOQ分别为2.0、2.0、1.0和50.0 μg/kg（表4）。

2.4 回收率和精密度

在青虾空白基质中分别添加3个浓度水平的兽药混合标准工作液，每个添加浓度重复6次，计算添加回收率和测定结果的相对标准偏差（RSD）。从表4

可以看出，在LOQ、2LOQ、5LOQ 3个加标水平上，磺胺类平均回收率在71.4%～110.0%，RSD在0.2%～9.4%;氟喹诺酮类平均回收率在75.9%～109.8%，RSD在2.0%～9.6%;酰胺醇类平均回收率在84.3%～108.3%，RSD在3.2%～7.7%;四环素平均回收率在70.1%～109.0%，RSD在0.2%～9.8%;符合化学分析方法验证确认和内部质量控制要求中关于正确度和精密度的要求[14]。

2.5 实际样品测定 将该方法应用于检测40批次青虾中27种兽药残留，结果检出恩诺沙星样品3份，残留量在24.7～70.8 μg/kg;用国家标准方法GB/T 21312—2007[15]测定，结果一致。

3 结论

该研究建立了青虾中4类共27种兽药QuEChERS净化的样品前处理和UPLC-MS/MS同位素内标法，与国标方法相比，实现了多兽药残留同时检测。采用3个加标水平的兽药对该方法进行验证，结果表明，该方法操作简便、快速、结果稳定，能满足日常检测工作需要。

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