胶质瘤细胞体外培养技术及应用研究进展

敬聪 丁向前 王君 邹杨鸿 王志刚 余化霖 耿鑫

神经胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的恶性肿瘤。神经系统恶性肿瘤中，胶质瘤约占80%，目前最常见的治疗方法是手术切除、放疗、化疗[1]。高级别恶性胶质瘤在成人原发性脑肿瘤中最常见，通过外科手术、放化疗等积极治疗，1年和5年生存率分别为30%和13%[1]。胶质母细胞瘤的侵袭程度最高，确诊后患者仅有15个月左右的的中位生存期，5年生存率为也仅为6.8%[2]。而引起这个结果的原因是胶质瘤细胞具有高度侵袭性，使得外科手术难以完整切除胶质瘤肿瘤组织；同时，由于胶质瘤的生物学特性复杂，对常规放、化疗不敏感，导致治疗效果极差，常容易复发[1]。手术切除后，大部分患者在手术切缘2～3 cm内复发，因此，需要探索一些新的治疗方法。通过对胶质瘤细胞的培养及实验，可以从从分子、基因等水平等揭示胶质瘤的生物学特性。神经瘤细胞体外培养技术在肿瘤研究方面具有很多独特的优势，在神经科学研究中占据重要地位。但神经细胞体外培养条件要求高、难度极大又制约了其发展。因为胶质细胞瘤具有高度异质性，在肿瘤内部的不同细胞以及肿瘤微环境之间具有复杂的相互作用，因此，我们需要找到一个最佳的培养条件，保持分子基因型和表型以及原始肿瘤在体外和体内的异质性。下面本文回顾常见胶质瘤细胞体外培养技术及胶质瘤细胞培养在常用研究中的应用作一综述。

1 细胞来源

细胞培养为研究过程中维护细胞提供了体外环境，许多培养技术可用于肿瘤和非肿瘤细胞的生长和维护。选择合适的细胞来源和体外试验的细胞培养程序与试验本身同样重要[3]。

1.1 经典细胞系 胶质瘤的细胞多来自人类和大鼠胶质瘤的细胞株，经典的细胞系如U87MG、U251、U6和T98G等，培养在含有血清的培养基中，随着传代次数的增加，其细胞在表型和基因型上与原发性肿瘤存在差异。尽管血清培养的神经胶质瘤细胞可以随着传代次数的增加显示出潜在的致癌能力，但它却不能反映亲本肿瘤的表型[4]。许多目前可用的胶质瘤细胞株缺乏与肿瘤类型、分级、位置、患者年龄等相关的临床信息，因此难以将研究结果与患者病情和临床病程相联系[3]。由于这些原因，传统建立的细胞系不能提供可靠的模型系统来了解胶质瘤的机制和治疗的相互作用。

1.2 患者来源的细胞系 由于胶质瘤细胞原代培养因成功率较低，因此过去大多数研究人员未采用原代培养。随着培养技术的进步，如今，研究人员更喜欢从原代细胞培养，而不是使用已建立的细胞株，因为它们具有更高的生物学和表型相关性[3]，更适合用于侵袭性、敏感性等基础实验，其结果更能接近人体的真实情况，这是未来研究的细胞选择趋势。原代细胞通常来自于手术切换的患者标本。组织首先洗去多余的碎屑和血液，被机械碾碎，然后用胰酶和脱氧核糖核酶消化，经过几次洗涤和离心步骤后，消化的组织被滴定并通过细胞过滤器，最后，细胞通过离心、重新悬浮和培养在神经基质介质中。原代细胞可以在空白的平板中作为非粘附性神经球生长，也可以在层粘连蛋白或聚赖氨酸包被的平板中作为粘附细胞生长[4]。然而，随着传代数量的增加(20～30传代)，培养的患者来源的胶质瘤肿瘤细胞表现出显著的基因组和转录变化[5]。另外，可以将源自患者的神经胶质瘤作为异种移植物直接移植到小鼠体内，而不是保持培养瓶中，然后作为系列异种移植物来保持。这些方法受到某些人的青睐，因为这些条件可再现地保持原始肿瘤的组织病理学，基因组和表型特征[6]。

2 胶质瘤细胞体外培养技术

传统的细胞培养技术属于二维(two-dimensional，2D)培养技术，因为其成本低，可操作性强而普及。但随着研究的深入，研究这发现大多数细胞在正常生理状态下是三维(three-dimensional，3D)结构，且3D结构的微环境较2D差异较大，所以随着材料、技术的进步，3D细胞培养技术正逐步普及。

2.1 2D培养技术 单细胞悬浮培养是2D培养技术的一种，它是将离体组织块通过物理法(金属网挤压和尖吸管吹打)或化学法(胰蛋白酶)或两者结合，以分离出单个细胞，然后接种在培养瓶中进行培养。还有一种是利用新采集的胶质瘤组织，将其附着在培养瓶内，大约1～2 d后，胶质瘤细胞会游离出来，然后再利用游离的胶质瘤细胞进行培养[7]。胶质瘤细胞最初采用悬浮培养法，然而，胶质瘤细胞的特征并不是悬浮生存，也不是它增殖的必要条件。大部分细胞是贴壁生长。贴壁单层细胞有很多实验优势，特别是在培养同质性、成像方法、克隆繁殖/挑选、筛选和定量方面，从而克服了悬浮培养的一些固有限制。传代培养就更简单，一般将需要的细胞种植在培养瓶，待其达到需要的密度，再是使用胰蛋白酶吹打胶质瘤细胞，然后根据研究需要将胶质瘤细胞接种到对应的培养器械中。

在此基础上，加支持物进行培养、单细胞分离培养法、球体细胞培养法、悬浮培养方法等培养方法在也胶质瘤细胞单层细胞培养上得到运用，如：加入支持物培养就是预先在培养器械中添加支持物，这样是为了更好的进行实验研究及观察。爬片，就是为了做细胞免疫组织化学分析而设计的，其方法是预先在培养板上放一个小载玻片，然后在其上培养肿瘤细胞，待条件成熟后再取出、固定并染色的一系列过程。单细胞分离培养也称克隆培养，我国研究者通过虹吸法将SHG-44单克隆化，建立了具有3种不同分化水平的胶质瘤细胞系[8]。球形培养，是将生长成片状的细胞移动到不容易附着的基底部，并且使细胞片卷曲生长成球状。冯利强等[9]还运用悬浮培养法培养C6胶质瘤细胞系中脑肿瘤干细胞，并认为该方法与其他方法培养的细胞在形态上无差别。

2.2 3D培养技术 尽管单层细胞培养现在应用广泛，但培养的细胞遗传不稳定；它是2D结构，而人体是3D结构。在细胞的生长、发育、分化中，细胞的微环境起着至关重要的作用，针对这些问题，研究人员开始尝试使用3D系统培养细胞，如肿瘤衍生器官、有机多细胞球体、多细胞肿瘤球体或肿瘤衍生球体，以更好地展示胶质瘤异质性和微环境。此外，在细胞形态上，因为3D培养更能重现人脑微环境，所以通过3D培养技术培养的细胞在形态、功能、生物学特性上更接近于体内存活状态。Wei等[10]研究显示，与单层细胞培养相比，用3D系统培养的肿瘤细胞中干细胞相关基因和蛋白表达水平、侵袭能力、恶性胶质瘤和治疗耐药均有所增加。卢虎生等[11]利用2D及3D培养分别对U251胶质瘤细胞系进行培养，结果发现通过3D培养的U251细胞系增殖速度更快，增殖指数、细胞周期、免疫组化等结果更接近于临床标本。所以，在3D培养中培养的神经胶质瘤细胞更能反映出细胞本身的行为及特性[12]。Gomez-Roman等[13]利用2D和3D系统中培养出相同胶质瘤细胞系，对放射敏感性的结果却相反，3D系统培养的细胞对放射线敏感，而2D系统培养的细胞对放射线无反应。这些结果为传统二维细胞培养系统的结果经常未能预测临床疗效提供了潜在的解释，而且这种现象也会导致不当和过度使用动物试验。

然而，3D培养也有不足之处，如它不能100%模拟人体内微环境、细胞生长到已成程度时营养缺乏等，但是这些问题现在我们已经在慢慢解决。如生物打印技术的进步，使得我们现在可以进行复杂的多细胞3D环境组装。Duarte等[14]利用生物打印将内皮细胞、基质细胞和永生化的神经母细胞瘤细胞排列成胶质瘤样水凝胶，其具有独特的空间特征模仿了人类大脑的解剖结构。在脑类器官内共培养肿瘤细胞会导致肿瘤形成和侵袭，其模式与患者的手术标本相似。从准确的解剖学模型上得的药物和侵袭研究，但仍缺少生物学相互作用。

2.3 其他培养方法 将两种或两种以上的细胞一起培养，称为共培养方法，不过其本质也是单层细胞培养技术。李振业等[15]利用共培养体系，培养恶性胶质瘤细胞和血管内皮细胞研究CD、VEGFR-1基因，结果显示该基因对细胞VEGF的表达及细胞增殖有抑制作用。另有将球状细胞培养和单层培养相结合，以提高在无血清条件下的人胶质瘤细胞系的衍生效率。所以体外共培养模型为现在不能解决的问题提供了一个独特的思路。除了上述培养方法以外，还有研究人员将两种及两种以上的方法联合应用，如同时采用单层培养及3D培养。还有学者利用将水凝胶使用在体外培养体系中作为涂层材料或3D生长系统来模拟肿瘤微环境，较普通培养瓶效果明确。还有目前一些新的培养技术如人源肿瘤异种移植模型、迷你大脑模型、脑片技术等等。这些方法其本质仍是上述培养技术，仅是利用很多新技术来改变胶质瘤细胞的培养环境，不过这些新颖的模型可以更好地概括肿瘤动力学和微环境的相互作用，从而能够更准确地了解胶质瘤的生物学特性。

3 胶质瘤细胞在各类研究中的应用

3.1 药物研究 胶质瘤细胞对化疗敏感性差，主要是因为目前尚缺乏敏感有效的化疗治疗药物，而且由于血脑屏障及耐药性的存在，使得胶质瘤的治疗效果相对较差[1]。因此我们需要新的药物来治疗胶质瘤，这使细胞培养显得尤其重要。

胡燕玲等[16]研究显示，地塞米松可在G1到S转折点阻滞C6 细胞周期，从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。Das等[17]通过对U87-MG细胞系研究，先使用地塞米松，再使用莫奈唑胺，胶质瘤细胞系不会凋亡，从而指导我们在临床治疗胶质瘤患者中，合理使用地塞米松。赵舰等[18]研究发现，百消安可以胶质瘤细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达，从而抑制U87细胞系的增殖，促进其凋亡形成。

中药是我国的传统文化，中药治疗胶质瘤也是目前的热门研究方向。陈雪等[19]研究表明，五味子甲素通过下调CyclinD1蛋白表达水平、上调促凋亡因子Bax和Bcl-2表达水平而抑制C6细胞的生长。Liu等[20]对雷公藤的研究中发现，雷公藤红素在U251、U87-MG和C6细胞系以及动物模型中可诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡，增加自噬体形成，进一步研究显示雷公藤通过激活ROS/JNK信号通路，阻断Akt/mTOR信号通路，引起G2/M期阻滞，触发细胞凋亡和自噬。吴海霞[21]在胶质瘤动物和细胞模型研究发现，川芎挥发油联合莫奈唑胺与莫奈唑胺单独给药相比，联合用药组的肿瘤抑制效果更好，而且抑瘤效果与川芎挥发油的浓度呈正相关。赵亚鹏等[22]对胶质瘤细胞系T98G和LN18予以不同浓度的重楼皂苷Ⅱ处理，发现其可降低胶质瘤的增殖及侵袭性，进一步研究发现其还能增加替莫唑胺对胶质瘤的抑制。

3.2 放射敏感性研究 不同胶质瘤细胞系特点不一样，研究显示T98和MO54细胞系对辐射敏感性完全相反[23]。Ostruszka等[24]研究发现，U251细胞系比D54细胞系在受到放射线时更敏感，存在这种差异的原因是P53基因是突变型还是野生型。Chen等[25]在靶向辐射增敏的研究中也运用了突变型和野生型P53两个胶质瘤细胞系，证明P53基因是胶质瘤细胞系放射线敏感与否的关键因素。刘宇驰等[26]对U373细胞进行研究显示，下调磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，可以影响CIN、切丝蛋白1表达，从而使U373细胞的对放疗更敏感。王冉冉等[27]研究显示，通过对胶质瘤U251和RR-U251细胞系进行研究发现，升高 TPM1的表达，可以明细提高胶质瘤细胞的放射敏感性，提示TPM1可能是胶质瘤放射敏感相关的潜在靶点。李文清等[28]研究显示，对胶质瘤U251细胞系给予放射治疗，发现CDK7抑制剂THZ1具有降低细胞修复的能力，诱导细胞产生凋亡，增加放射敏感性。

3.3 免疫治疗研究 目前，胶质瘤的免疫治疗是一大热门，因胶质瘤的自身生物学特性，即使在外周血中检测到循环肿瘤细胞，但其几乎不会转移到颅外。进一步的研究证实外周环境对胶质瘤细胞具有免疫作用，所以现在亟需明确其免疫学机制。Friese等[29]使用人和鼠的胶质瘤细胞系来研究NK，γδT和CD8+T细胞的肿瘤免疫刺激肿瘤细胞表达，激活免疫受体NKG2D。在胶质瘤细胞中，PD-L1高表达[30]。在胶质瘤微环境中，PD1/PD-L1信号传导可以影响早期T细胞活化，抑制胶质瘤细胞毒性、增生和促炎细胞因子的产生。由于中枢神经系统的免疫反应低，胶质瘤与其他肿瘤相比在以PD-1为靶点治疗的效果较差。同时，由于胶质瘤的多样性，不同胶质瘤存在异质性，导致微环境也具有差异性，也使得利用PD1/PD-L1的治疗方法出现更多挑战。单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的主要方向，mAbs具有诱发直接细胞杀灭和调节细胞免疫反应的潜力，表皮生长因子受体 (EGFR) 的突变代表了胶质瘤关键遗传特征，直接针对 EGFR 的 mAb 被用作胶质瘤中众所周知的治疗方法。

肿瘤疫苗也是免疫研究的一部分，因其能够激励宿主免疫系统识别和杀死肿瘤细胞，如胶质瘤疫苗可以使用树突细胞(Dendritic cells，DCs)制备，主要是因为DCs作为传递细胞，激活细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。陈兴胜等[31]通过研究显示，通过上调脑胶质瘤细胞DCs中凝血酶敏感蛋白1的表达，可以抑制DCs的成熟，使其分泌的细胞因子具有免疫抑制作用。曾山等[32]将C6细胞、9L细胞及其裂解物作为免疫原来制备疫苗，用它来降低载瘤大鼠胶质瘤组织的侵袭性，延长大鼠的生存期。Tang等[33]对具有免疫活性小鼠上的GL261肿瘤采用疫苗 IL15Rα联合T细胞治疗、雷帕霉素和塞来昔布治疗，发现很好的抗肿瘤效果。

溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)治疗是近年来新型的具有特异性肿瘤治疗方法，其基于病毒在癌细胞中的选择性复制和随后的破坏作用，其最初被认为是与免疫治疗分开的一种治疗策略，然而，溶瘤病毒感染引起的抗肿瘤免疫反应模糊了这一区别[34]。由于血脑屏障的存在，导致化疗无法达到满意的效果，而OV由于其具有较小结构，对于神经系统肿瘤的治疗具有独特的优势。欧阳一彬等[35]利用胶质瘤GL261细胞系体外实验证实，重组溶瘤腺病毒Ad3-aLAC可抑制胶质瘤细胞增殖，同时在体内实验显示其可增强抗肿瘤的免疫反应，为胶质瘤的OV治疗提供新的思路。

3.4 建立动物模型 动物模型在研究胶质瘤的发病机制、特征等方面有重要意义，而动物模型的建立同样需要应用胶质瘤细胞的培养。汪柳旭等[36]在Balb/c裸鼠右侧背部下方接种U87胶质瘤细胞，建立鼠胶质瘤载瘤模型，用于胶质瘤治疗方面的研究。Kim等[37]研究PD-1、抗TIM-3与放射治疗的联合治疗效果，为免疫治疗与放射治疗的联合治疗提供了新的策略。虽然动物模型可以提供与人体十分接近的胶质瘤生存的微环境，但是肿瘤细胞难以直接观察和追踪，造模价格通常十分昂贵，且缺乏可重复性。

3.5 其他研究中的应用 除了上述研究外，神经胶质瘤细胞培养还广泛用于其他研究领域，例如探索胶质瘤细胞凋亡与侵袭转移机制研究。Zhang等[38]使用原代培养的神经胶质瘤细胞和原代培养的星形细胞研究恶性神经胶质瘤细胞与星形胶质细胞之间的直接间隙连接，发现与胶质瘤细胞的直接细胞耦合会导致星细胞的表型转化，从而增加胶质瘤对周围组织的易感性。胡斌[39]通过研究对人脑胶质瘤细胞U251发现，抑制PI3K/Akt通路，能增加胶质瘤细胞的凋亡。江晓珍等[40]对胶质瘤细胞株U87MG、U251研究发现，巨噬细胞移动因子通过PI3K/Akt途径抑制胶质瘤细胞的凋亡。刘纪营等[41]对U87胶质瘤细胞系研究发现，利用RNA技术下调胶质瘤细胞的KIF20A表达，可以抑制其增殖、迁移及侵袭能力，诱导细胞周期G0/G1期阻滞，促进其凋亡形成。李梅等[42]首次发现光动力学疗法对C6胶质瘤细胞具有杀伤作用。还有一些如长链非编码RNA，微小RNA等对胶质瘤的治疗或侵袭性机制的研究。还有一些未列出的研究，其都显示了细胞培养技术在研究中的重要性。

神经胶质瘤因其独特的侵袭性而困扰研究人员，为了延长胶质瘤患者生存率，明确驱动迁移和侵袭的关键机制十分重要。体外方法是预测胶质瘤细胞如何侵袭的重要手段，与体内模型相比，更容易操作和复现，且成本较低。目前胶质瘤细胞培养方法众多。目前最热门的培养方法是3D培养技术，因其可以近似的模拟脑内微环境，更准确的反映胶质瘤细胞的生物学特性，更有效的寻找药物治疗靶点及药物开发。胶质瘤干细胞如今也是一个新的研究热点，该研究未来可能称为治疗胶质瘤的新的方向。相信随着生物医学工程技术的进步，在胶质瘤细胞培养技术可以得到升级，也会应用到一些目前未知的新的领域。

而且，选择适当的细胞系和细胞培养条件对于保持神经胶质瘤肿瘤的侵袭行为至关重要。例如，神经胶质瘤中干细胞和非干细胞群体的组成受微环境影响并影响迁移潜力，因此以维持这些细胞群体的培养方式至关重要[43]。此外，患者来源神经胶质瘤细胞可以更好的显示胶质瘤的生物学特性，在研究肿瘤的药物敏感性和反应性时可能更有益。

使用体外测定的目的是在不显著损害体内环境的情况下平衡成本和可重复性，以更准确和有效地解决特定的生物学问题。只有当体外的培养体系与人体环境更相似时，我们针对胶质瘤的治疗方法的研究才能更加深入，且更具有针对性，且更加有效。因此，在选择培养方法时，必须考虑其能多大程度上重建体内环境，而且必须权衡其可重复性、难易程度和成本。