AIDS患者ELISA法HIV抗体检测结果错误相关影响因素分析及干预策略①

唐 杰，于永敏，冯 煦，常瑞霞

(郑州市第六人民医院检验科，河南 郑州 450000)

艾滋病(Acquired Immuno Deficiency Syndrome，AIDS)是临床常见免疫缺陷性疾病，传染性较强，传播途径广泛，且近年来发病率逐渐上升，病死率较高，会严重威胁患者生命安全[1]。临床应采用安全可靠筛查方法进行尽早确诊治疗。人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是其艾滋病传染病毒，采用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)对其抗体水平进行检测能确认HIV感染情况，但临床实际操作过程中，易受到多种影响因素影响，出现检测结果错误，临床应针对性采取一定干预措施[2]。本研究选取我院AIDS患者98例，旨在分析ELISA法检测HIV抗体结果错误相关影响因素，并对干预策略进行探讨。现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取我院AIDS患者98例(2019-08～2020-08)，其中男52例，女46例；年龄19～54岁，平均(35.28±7.56)岁。纳入标准：均经HIV抗体筛查为AIDS；均经蛋白印迹实验(WB)检查确诊为AIDS；均为感染门诊、孕前检查等；均签署知情同意书。排除标准：精神或意识障碍；合并其他免疫系统疾病；合并恶性肿瘤、严重功能脏器障碍。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理： 抽取AIDS患者3mL新鲜空腹静脉血，并注意保证无菌，防止剧烈震荡；于常温下放置1～2h，血液凝固后进行离心分离，速度为1500～3000r/min，时间为10～15min，于2～8℃下保存，5d内进行检测。

1.2.2 ELISA法检测： 选择艾德康生物科技有限公司的Addcare Elisa1100型全自动酶免分析仪，英国Biochrom公司的安图自动洗板机，北京万泰生物药业股份有限公司的人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒(国药准字S20080008)，上海一恒科技仪器有限公司的DK-600A型恒温水箱，大龙医疗设备(上海)有限公司的Finnpipette可调移液器。将样品采用缓冲液进行稀释，每孔加100μL，设置2排阴性对照孔及平行孔，于4℃下包被12～18h；然后于37℃采用封闭液进行封闭1h，采用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3次，2min/次，加入100μL稀释后的一抗，于37℃下保温孵育30min，再用PBST洗涤2min；加入100μL辣根过氧化物酶标记的二抗，于37℃下保温孵育15min，洗涤后加入50μL显色A液、B液，5min后加入终止液50μL，最终采用450nm波长测量各孔吸光度(OD)值，计算HIV抗体浓度。HIV抗体阳性判断标准：样本OD值/阳性判断值(S/C.O)≥1为阳性，<1为阴性。

1.2.3 蛋白印迹实验： (1)样品的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，加样并在同一块胶上按顺序做重复点样，用于免疫鉴定及蛋白染色显带。(2)转移印迹，a转移前将滤纸、硝酸纤维素膜剪成与胶一样大小，浸入蒸馏水中10～20min转移至buffer中并平衡30min；b凝胶平衡，将电泳后胶板置于buffer中并平衡30～60min；c逐层铺开，保证各层之间无皱褶、气泡；d开始转移，连接正负极，盖上盖子并连接电源，以恒流0.8mA/cm室温下转移1h，转移后凝胶再用氨基黑染色液进行20min染色，脱色后检测效果。(3)免疫染色，a转移后的硝酸纤维素膜置于5%脱脂奶粉中封闭，于4℃下过夜；b采用三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜1～2次，10min/次；c加入辣根过氧化物标记的抗体，室温下放置1h；d三乙醇胺缓冲盐水溶液冲洗3次，10min/次；e硝酸纤维素膜转入过氧化物酶显色液中，置于暗处进行反应，达到最佳程度时，采用三蒸水洗涤后终止反应。

1.3 观察指标

(1)ELISA法检测HIV抗体的结果。(2)ELISA法检测HIV抗体结果错误相关影响因素。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0对数据进行分析，计数资料以n(%)表示，行χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA法检测HIV抗体的结果

98例AIDS患者经ELISA法检测结果中HIV抗体阳性92例，阴性6例；ELISA法诊断符合率为93.88%(92/98)。

2.2 ELISA法检测HIV抗体结果错误相关影响因素

经调查分析发现，ELISA法检测HIV抗体结果错误相关影响因素包括标本干扰因素、试剂选取及处理、仪器调试及操作、温度控制、技术人员因素等多种因素。漏诊患者中1例原因为标本中含有补体，1例为标本溶血，1例为标本污染，1例为标本处理不当，1例为试剂选取不当，1例为温度控制不佳。

3 讨论

AIDS患者HIV病毒主要攻击人类免疫系统，多伴有发热咳嗽、腹泻便血、精神智力障碍、偏瘫等精神异常，临床应给予早期诊断治疗，挽救患者生命，延长生存期限[3]。

HIV抗体检测是临床常用检测确诊手段，本研究98例AIDS患者经ELISA法检测结果中HIV抗体阳性92例，阴性6例；ELISA法诊断符合率为93.88%。ELISA属于固相免疫检测方法，具有便捷简单、特异性强、灵敏度高的优势，且能多次重复操作，但操作过程中会出现HIV抗体结果错误，影响诊断效果[4]。且邹竹芳[5]学者研究表明，ELISA法检测HIV抗体过程中，血液标本保存是影响检测结果的最重要因素。本研究中出现6例漏诊，其中1例漏诊是由于标本中含有补体，1例为标本溶血，1例为标本污染，1例为标本处理不当，1例为试剂选取不当，1例为温度控制不佳，与付晶鑫[8]学者研究中ELISA法检测HIV抗体涉及试剂、标本、人员操作、温度等多种因素具有一致性。标本因素是HIV抗体结果错误的最重要影响因素，标本采集过程中极易受到高浓度非特异性免疫球蛋白、补体、类风湿因子，会导致检测结果出现误诊；且标本采集、送检、保存过程中会由于操作不当导致溶血、污染，且标本储存时间过长，凝集不全[6]。ELISA试剂可能已经超过有效使用期，且不同厂家及批号试剂中酶标记物浓度不一定相同，或者运输储存条件不达标，导致敏感性、特异性降低，导致酶试剂失活[7]。检测仪器由于长时间缺乏维护，灰尘遮挡光学系统影响波长变化；洗板机使用后冲洗不及时，发生堵塞影响检测效果，且在加样过程中移液枪使用过程中会出现偏差；或者出现正常运行但检测结果易出现偏差，影响HIV抗体检测结果准确性。温度是影响ELISA法检测过程中的重要因素，酶类物质反应在很大程度上受到温度影响，温度过高或过低均会影响酶反应活性，进而影响检测准确性[9]。

据此，临床应采取相应干预措施：(1)标本采集后可将0.01mol/L浓度、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行稀释，并在56℃下灭活30min；(2)标本采集过程中应严格遵循无菌操作，并避免剧烈震荡引起溶血，并在采集后于常温下放置1h，血液凝固后进行离心，加入抗凝物质时尽可能不用酶抑制剂，避免对ELISA试剂中酶活性的影响；(3)试剂使用之前查看使用期限，并避免不同厂家或批号的酶试剂混用，储存条件应在2～8℃，不可反复受热及冻融，使用前进行预处理，保持与室温相似，避免影响抗原抗体结合反应速度，引起结果差异；(4)应对仪器进行定期清理，酶标仪在使用前开机预热30min，洗板机在使用后及时冲洗管路5～6次，加样时先摇晃滴瓶，预吸后挤去第一滴后进行滴加，避免产生气泡，并加到酶标板底部，避免污染样本。(5)采用恒温箱控制温度，并在恒温箱内放置温度计，并等温度平衡后使用，未用完的实验试剂保存于有干燥剂的密封袋中并放入冰箱中保存。

综上所述，ELISA法检测AIDS患者HIV抗体结果错误相关影响因素与标本、试剂、仪器、操作等多个环节均密切相关，临床应据此制定针对性干预策略，进一步提高检测准确性，为AIDS的排查筛除提供一定科学依据。