蛋白酶与抗蛋白酶系统失衡在COPD发病中的研究进展

张毅，陈剑，叶静凡，张继华

（玉溪市人民医院，云南 玉溪 653100）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续气流受限为特征的呼吸系统常见疾病，严重危害人类健康的常见病，影响患者的生命质量，是导致死亡的重要病因。我国慢阻肺发病率逐年上升，2018年王辰院士研究显示，我国20岁及以上成人慢阻肺患病率为 8.6%，40 岁以上人群患病率高达 13.7%，估算我国患者数近 1亿[1]。2016年调查显示，慢阻肺已成为我国第5大死亡原因[2]。因此，从COPD的发病机制探寻其预防和治疗策略尤为重要。COPD的本质特征为肺血管、肺实质、气道慢性炎症性病变。大量研究表明，COPD的致病因素主要有氧化应激和炎症，而蛋白酶与抗蛋白酶失衡也是其重要的发病机制之一[3]。早有学术假说指出，蛋白酶能够将肺泡壁上的弹性蛋白以及其他蛋白结构消化，造成COPD肺组织损伤，其中包括基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases,MMPs）、中 性 粒 细 胞 弹 性 蛋 白 酶（Neutrophil Elastase，NE）[4]；而蛋白酶的这种作用又会受到抗蛋白酶系统的对抗，其中，分泌性白细胞蛋白酶抑制物（secretory leucocyte protease inhibitor，SLPI）、α1抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin deficiency，α1-AT）、组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metallo proteinases，TIMPs）发挥重要作用[5]。COPD 患者抗蛋白酶表达水平降低而蛋白酶表达水平升高，二者失衡最终导致COPD的发生及恶化。本文就蛋白酶与抗蛋白酶系统以及二者失衡在COPD中的研究进展进行综述。

1 中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）

1.1 NE的来源、生物学特性

人体11号染色体q14处是NE基因的位置所在，它含有4个内含子与5个外显子，其中内含子保存着丝氨酸蛋白酶基因结构（与典型颗粒相关）。作为丝氨酸蛋白酶超家族的成员，NE是由若干个同源酶组成的（具有不同的糖基化程度），达到33ku的分子量，肺泡巨噬细胞与肺内多型核中性粒细胞（简称PMN）是其主要来源。NE还是杂食性酶，能够使多种蛋白溶解，对弹性蛋白的溶解效果最好。PMN在正常情况下所释放的NE仅占其重量的2%以下。生理条件正常时，体内有多种蛋白酶抑制剂存在，蛋白酶的大量释放受到抑制，从而起到对肺组织的保护作用，α1-AT就是这些蛋白酶抑制剂中最为重要的一种。血液循环中NE总量的90%和α1-AT按照1：1的比例进行结合，形成NE-α1-AT复合物，可使α1-AT的活性丧失，单核-巨噬细胞系统则会将失去活性的α1-AT清除。由此可见，肺组织的稳定性主要靠抗蛋白酶和NE的平衡来维持。Laurell与Eriksson在1963年就曾经报道，体内缺乏α1-AT的病人，在NE的作用下会出现早期肺气肿的症状[6]。在肺气肿发病机制的相关研究中，该理论假设具有四十年的历史。

1.2 COPD与NE

当人体吸入刺激物（如吸烟）时，肺实质和周围气道会被诱发炎性反应，巨噬细胞也将会被激活[7]。在COPD的炎症过程中，巨噬细胞的作用非常大，上皮细胞、巨噬细胞以及CD8+T淋巴细胞被激活以后能够将中性粒细胞趋化因子释放出来。PMN在趋化因子的作用下发生聚集和激活，然后将NE释放出来，而得到释放的NE则能够发生裂解并与α1-AT结合，气道细胞SLPI的分泌因而减少，肺内NE活性将会随着NE抑制物的减少而持续。L.Bizeto等在研究中将22例COPD肺功能病人分成两组：重度病人和中度病人，然后分析了两组病人的痰液和血清NE与α1-AT的相关性，结果显示：α1-AT在两组病人血清中的浓度都比正常水平高，并且两组病人之间的差异并不显著。中度病人的NE浓度水平与FEV1呈负相关关系，与α1-AT的关系则为正相关关系[8]。在机体炎症级联反应中，NE是主要的炎症损伤造成者，它能够对肺组织造成直接的损伤。NE除了能直接溶解组织结构蛋白，而且还能对IL-6、IL-8等细胞因子以及粒细胞刺激因子的表达起到诱导作用，使更多中性粒细胞发生趋化和激活，能够导致炎症反应扩大。Nakamura通过体外研究指出，NE能够诱导支气管上皮细胞表达IL-8基因，从而使IL-8的浓度水平增加，IL-8反过来将更多中性粒细胞招募到支气管表面[9]。McElvaney在研究中发现采取雾化吸入α1-AT或SLPI的办法可以降低NE的活性，同时还会降低IL-8的水平[10]。这些研究均表明NE是诱导IL-8产生的重要诱导因子。在炎症状态下，PMN由于受到IL-8等炎症因子的刺激将大量NE释放出来，而钙调节蛋白则能够使脂多糖（LPS）的表达得到增强，从而对NE的释放起到诱导作用，蛋白聚糖与连接组织会被没有和α1-AT结合的NE所消化，从而引起肺气肿。多种研究表明，在肺气肿的形成和发展过程中，NE等蛋白水解酶起到重要作用。研究发现，COPD急性加重期患者的肺组织中弹性蛋白发生了更多的降解，而肺气肿患者肺结构改变的一个重要特征就是弹性蛋白的减少。

1.3 NE抑制剂

多种蛋白酶抑制剂能够对NE的活性起到调控作用。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂（Neutrophil elastase inhibitors，NEI）能够对NE的活性进行抑制，对趋化因子与炎症细胞因子的释放也起到调节作用，而且对炎症细胞的激活、跨膜转移也起到抑制作用，其抗炎效应是多层次的。NEI有两大类，一种是人工合成的，另一种是内源性的。丝氨酸蛋白酶抑制剂家族是主要的内源性NEI，如特异性蛋白酶抑制剂、α1-巨球蛋白、SLPI、α1-PI（α1-蛋白酶抑制剂）。而 SC37698、FR134043、FK706、DMP777、西维来司钠（sivelestat，ONO-5046）等都是当前主要的人工合成NEI。其中，DMP777的生产商是美国杜邦制药，它是一种人工合成的高效和高选择的NE抑制剂。C20H21N2NaO7S-Na-4H2O为西维来司钠的分子式，其分子量是528.51U，它能够向组织和细胞内进行有效渗透，对氧化剂不敏感，能够对NE活性、NE的分泌以及合成进行抑制，在急性肺损伤和全身性炎症反应综合征中多会采用此药。

2 基质金属蛋白酶（MMPs）

2.1 MMPs定义、分类与结构

20多种高度保守的钙离子、锌离子依赖性蛋白内切酶共同组成了基质金属蛋白酶，它能够对细胞外基质（ECM）的大部分蛋白起到降解作用。MMPs主要以酶原的形式分泌，在肿瘤细胞、炎症细胞、正常组织细胞中均能够产生，在有机汞制剂反应或蛋白酶水解的条件下才能将其激活，从结构上看，其同源性达到40%-50%，它参与炎症反应、血管生成、细胞迁移、修复或重建组织的各个方面。MMPs的共同结构域主要有以下五个：（1）前肽区，抑制活化信号；（2）N端信号肽区，负责启动调节信号；（3）羧基末端区，其组成要素为四个类血红蛋白重复序列；（4）脯氨酸含量丰富的铰链区，处在催化区与类血红蛋白结合蛋白区之间；（5）催化活性区，在酶催化作用中的作用非常重要，有锌离子结合位点。

2.2 MMP-9与COPD

2.2.1 MMP-9来源、生物学特性

在论述COPD患者肺组织结构重塑中MMPs所起的作用上，本文以MMP-9为代表来进行说明。MMP-9的分子质量为92ku，别称为明胶酶B，人体肺组织在正常情况下，MMP-9的表达水平相对较低，不容易被检测到；在COPD患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）、血清和痰液中，其表达水平有所提高。相关研究显示，巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等炎性细胞是肺组织中MMP-9的主要来源。MMP-9不仅能够对抗蛋白酶和蛋白结构起到降解作用，而且借助对基质结合型成纤维细胞生长因子与细胞因子的调节，来实现对细胞功能进行改变。MMP-9的基因处在与气道高反应性相关的位点（染色体20q11.1-13.1的位置），处在2-kb5侧翼区的MMP-9启动子区包含刺激蛋白SP-1因子结合点、AP-2、活化蛋白AP-1；人类机体的MMP-9还包含转化生长因子TGF-β抑制元件、Ets结合位点、核因子NF-κB。利用结合MMP-9基因启动子区调节元件，生长因子、细胞因子和炎性因子能够对MMP-9的表达起到调节作用。

2.2.2 MMP-9的抑制

对于组织中的MMP-9来说，TIMP-1是一种具有天然活性的特异性抑制因子，炎性细胞因子、炎性细胞以及各种组织细胞均能够分泌TIMP-1。它的C端能够与MMP-9的活性形式的催化结构域或酶原的C端按照1：1的比例构成非共价复合物，通过与酶和底物结合或抑制酶的活性起到抑制作用，这种调节是一种转录后的调节。

2.2.3 MMP-9与气道重塑

在传统观点中，不完全可逆的气流受限、气道慢性炎症被看作COPD的特征。近年来的研究指出，气道壁结构的改变直接或间接地受到长期气道慢性炎症的影响，并与不完全可逆的气流受限具有相关性。气道重塑指的是气道壁结构的改变，是COPD的又一重要性特征改变。气道重塑在形态学和病理学中包括微血管生成，平滑肌增生、肥大、气道上皮下纤维化等，其显著特征是平滑肌和气道壁增厚，气道慢性炎症反复刺激是气道重塑的重要起因。TIMP-1与MMP-9的来源主要是中性粒细胞。在支气管组织中，升高MMP-9能够对ECM起到降解作用，炎症细胞因而会向炎症部分转移；MMP-9降解片段还能够趋化炎症细胞，从而加剧炎症的进展。随着MMP-9表达的升高，TIMP-1也会相应地升高，从而对MMP-9的活性、ECM的降解进行抑制，然而TIMP的过度升高将会降低MMP-9与TIMP-1的比值，引起ECM代谢紊乱，从而对气道重塑的发生和发展起到促进作用。目前已经有大量研究证明，COPD的产生及发展，与MMP-9和TIMP-1的比例变化具有很大的相关性；在支气管肺泡灌洗液中，气流阻塞程度与MMP-9与TIMP-1的比值增高之间呈负相关关系。Brajer等人通过研究指出，与对照组人员的血清MMP-9浓度水平相比，COPD患者要高于前者，并且在COPD患者身上还发现，FEV1、FEV1/FVC与MMP-9浓度之间呈负相关关系[11]。MMP-9引起气道重塑的机制如下：TNF-α、TGF-β等与基质有关的生长因子在MMP-9的刺激和激活作用下被释放，通过对细胞增殖、分化的诱导而参与到气道重塑中来。MMP-9还对纤维细胞增殖起到促进作用，刺激生成胶原，发生气道纤维化。

3 α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）

3.1 α1-AT生物学特性

α1-AT由394个氨基酸残基共同组成，其分子质量是52KD，属于APRP急性时相蛋白（由肝细胞分泌入血并作用于肺脏）的一种，对血液中NE诱导宿主组织损伤能够起到抑制作用；支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞均能产生α1-AT，这些α1-AT是在肝外合成的，在调节肺局部组织损伤方面的作用非常重要。α1-AT在正常情况下的血浆中含量为2.90±0.45g/L，其PH值是4.8，半衰期为 5-6天；由于蛋白酶抑制剂表型不同，人体内α1-AT浓度也不尽一致。PH值能够对α1-AT的抑制作用产生显著影响，在弱酸性与中性环境下表现出最大活性，在PH值超过4.5的情况下则基本丧失其活性。在肝病、妊娠、感染和炎症的情况下，α1-AT这种急性时相蛋白的浓度将会明显提高，会超过2mg/mL。在基质形成、组织修复、体内外免疫抑制以及炎症调节等方面，α1-AT均起到非常重要的作用。

3.2 α1-AT基因遗传性

α1-AT基因定位于14色体长臂的 14q31-32（41）位。当前已被发现的不同等位基因在100种以上，而S（频率为0.02）、Z（频率为0.05）则是最常见的缺陷变体[12]。WHO命名的“PiZZ”是α1-AT的常染色体共显性Z等位基因纯合突变，它是一种α1-AT缺乏的典型类型，与正常人相比，其血清中α1-AT水平仅达到10%~20%。单一氨基酸替代是引起Z等位基因形成的主要原因，赖氨酸在反应环基底部替代谷氨酸（Glu342→Lys），导致分子结构更容易向部分结合封锁状态转变。Z基因突变的蛋白产物由于在肝细胞内贮积而难以有效分泌，从而导致血清中α1-AT缺乏。以成年的PiZZ纯合突变患者来说，由于其肺循环中α1-AT的缺乏，导致NE对结缔组织所起的降解功能丧失，从而使机体发生肺气肿的风险明显升高[13]。欧美国家的白种人是发生先天性α1-AT 缺乏（α1-Antitrypsin deficiency，AATD）的主要群体，并且集中发生在高加索地区。美国在一项跟踪研究中选取了965例COPD患者，其中PiZZ表现为显性的患者占1.9%的比例；现有研究表明，先天性α1-AT缺乏者在东亚人群中并不常见[14]。

3.3 α1-AT与肺气肿

作为主要的血浆中丝氨酸蛋白酶抑制剂，α1-AT可对多种蛋白酶的活性起到抑制作用，如血纤维蛋白溶酶原、NE、PR3、Cathepsin G等。Z基因突变所引起的先天性α1-AT缺乏，导致NE-α1-AT复合物的生成被阻断，从而引起蛋白酶与抗蛋白酶系统失衡，减弱肺组织抑制弹性蛋白酶的能力，使肺组织中的弹性蛋白水解，而肺泡弹性蛋白的修复也会受到抑制，肺气肿由此形成，最终导致COPD的发生[15]。发生家族遗传性肺气肿的病理生理基础就是此类先天性AATD。此种家族型肺气肿确切的说是一种全腺泡型肺气肿，在患者未出现气道疾病的情况下，一般在45岁起出现进展，并且肺部疾病还会受到空气污染或吸烟等因素的影响。比如，蛋白酶和抗蛋白酶系统可能由于吸烟而发生紊乱，肺泡巨噬细胞在吸烟的影响下释放中性粒细胞趋化因子，中性粒细胞受此刺激释放出蛋白酶，使蛋白酶的活性增强。抗蛋白酶系统不能完全中和蛋白酶以及弹性蛋白酶的释放，进一步对亚临床肺损伤的发生起到促进作用[16]。AATD个体发生COPD的风险会明显增加，但在欧洲和美国，在AATD个体中发生COPD的比例仅有1%-2%[17]。

3.4 AATD的治疗

当前替代疗法是AATD的特殊治疗方法，该方法能够维持11µmol/L保护性阈值以及升高血浆中α1-AT水平[18]。具体的替代治疗方法主要有：（1）内源性替代治疗：即服用雌激素/黄体酮复合物、他莫昔分（tamoxifen）、达那唑（danazol）等肝细胞合成与分泌α1-AT药物。1980年，James E.Gadek等的研究中，每天用600mg 达那唑治疗1例无症状者（PiSZ）与7例严重肺气肿患者（包括1例M(duarte)Z与6例PiZZ），经过30天的治疗之后，血浆中α1-AT水平显著升高（平均升高37%：P<0.03）的有5例PiZZ患者；其他两例杂合子各自升高 87%（PiSZ）、85%（M(duarte)Z）[19]；（2）外源性替代治疗：Dirksen等在研究中，每周向PiZZ患者治疗组静脉注射 60mg/kg α1-AT（Prolastin®），同时给予对照组安慰剂，结果显示，相较于安慰组，治疗组的疗效更佳[20]。此外雾化吸入酵母衍生物重组α1-AT或人工合成α1-AT可以使α1-AT在肺上皮细胞衬液中的水平短期内升高，蛋白酶和抗蛋白酶的平衡也将得到恢复。在肺囊性纤维化中气道炎症的作用也将减弱，其原因在于，α1-AT能够使弹性蛋白酶的活性变弱、抑制IL-8的聚集、减少痰液中的中性粒细胞数量；（3）基因治疗：目前人们已经加深了对AATD基因缺乏特征的认识，加上基因序列的克隆，使得该治疗方法的应用前景非常广阔，现有研究还只应用于大鼠。Sihong Song等的研究在大鼠骨骼肌中以重组腺相关病毒（rAAV）转换成分泌治疗蛋白，结果发现α1-AT的表达得到了增强[21]；（4）肝移植法：肝脏是合成α1-AT的场所，因此在AATD的治疗技术中也可以采取肝移植的办法。Jain AB将肝移植手术应用于7例AATD患者，并在手术前后分别检测了患者的肺功能，结果发现其肺功能在手术前后的差异并不明显，但9年跟踪调查手术患者发现其存活率达到100%，并且发现患者血浆α1-AT水平在肝移植术后明显提升，从而抑制了肺气肿的进展[22]。

4 分泌性白细胞蛋白酶抑制物（SLPI）

SLPI是分泌性白细胞蛋白酶抑制物，其分子量是11.7kD，巨噬细胞、皮肤角质细胞、B细胞、呼吸道上皮Clara细胞与杯状细胞、PMNs非糖基化的阳性两域丝氨基酸蛋白酶抑制剂都能够产生SLPI。在人肺组织中天然含有SLPI，调节或抑制糜蛋白酶、胰蛋白酶、Cathepsin G、NE是其主要功能。SPLI不仅能够对蛋白酶的活性进行抑制，而且它还具有抗真菌及抗细菌的活性，对于单核-巨噬细胞促炎活性也能起到抑制作用。相关研究表明，SLPI能够对IkB-β与IkB-α降解进行抑制，从而对NF-κB的活性进行调节诱导。当前研究还不十分清楚SLPI在肺组织中的调控表达机制，不过可以明确的是IL-1b与TNF-α可以对SIPI的表达起到刺激作用。目前相关体外研究已经证实，NE 对于SLPI mRNA在肺上皮细胞中的表达能够起到促进作用，糖皮质激素还能够使蛋白质的释放与SLPI m RNA的表达得到提高，从而与NE协同促进使SLPI mRNA的表达得到提高。抑制NE的活性是SLPI的主要作用，所以其对COPD的发生和发展也起到非常重要的作用。

5 组织金属蛋白酶抑制物（TIMPs）

TIMPs为低分子质量蛋白质家族，它是MMPs内源性天然抑制因子，在体液和组织中广泛分布，其亚类主要有四种：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，内皮细胞和巨噬细胞是其主要来源，TIMPs分子N端功能区的半胱氨酸（Cys）残基能够结合MMPs的锌离子活性中心，按照1:1的比例以非共价键形式组成复合物，具有专一抑制其蛋白水解作用的特性。在TIMPs的所有亚类中，活性最强的是TIMP-1，其分子量是28.5ku，处在人体Xp11.23-11.4染色体的点位，能够对MMP-9的活性进行抑制，产生于多种细胞因子的诱导。对于MMP的激活，TIMP的抑制作用是从以下两个方面来实现的：（1）酶原活化阶段：由于pro-MMP和TIMP所组成的复合物比较稳定，pro-MMP酶原自我激活受到阻碍；（2）活化的MMP阶段：活化的MMP和TIMP以1：1的比例直接形成的复合物比较紧密，其活性因而受到抑制。当MMP-9的表达过度时，TIMP-1的水平将会相应的升高，从而对MMP-9的活性进行抑制，同时还能对ECM的降解进行抑制，TIMP-1的过度升高将会降低MMP和TIMP的比值，从而出现ECM代谢紊乱的情况，对气道重塑起到促进作用。可以说气道组织破坏和修复动态平衡的其中一个重要标志就是MMP-9和TIMP-1的动态平衡；COPD急性期与气道阻塞加重也可以从血清TIMP-1浓度得到进行反映，TIMP-1与MMP-9的浓度在COPD患者的痰液中会明显升高。Higashimoto Y等的研究表明，与对照组相比，COPD稳定期患者具有更高的血清TIMP-1浓度水平，并且其浓度还和FEV1/FVC表现出负相关关系。他们首次提出，COPD患者血清TIMP-1浓度和肺气肿的发生并不具有相关性，而是和气道阻塞相关[23]。

6 小结与展望

在COPD的发生发展当中，蛋白酶和抗蛋白酶系统的失衡起到非常关键的作用，肺组织弹性蛋白降解中NE/α1-AT失衡、气道重塑中MMPs/TIMPs失衡，均会导致COPD的发生及恶化，α1-AT、TIMPs、SLPI等相关药物在COPD治疗中的作用是值得今后深入研究的方向由此可见，我们在对疾病新治疗方法的探索一定要从其相应的发病机制入手，如此方能为其提供坚实有效的理论依据。