长白山地区药用植物龙胆DNA条形码鉴定△

张强，张维维，丁勇，王佳雪，方春秋，齐伟辰*

1.长春中医药大学 药学院，吉林 长春 130117；2.吉林省长白山中药资源工程研究中心，吉林 长春 130117

龙胆GentianascabraBunge为龙胆科多年生草本植物，为我国常用药用植物，其根及根茎入药，有极其重要的经济价值和药用价值。龙胆主产东北地区，春、秋二季均可采收，以秋采者质量最佳。龙胆含有多种化学成分且药理活性显著，能够保肝、健胃、抗炎、抗菌、调节免疫力等[1]。《中华人民共和国药典》2015年版记载中药龙胆的基原植物包括龙胆、三花龙胆G.trifloraPall.、条叶龙胆G.manshuricaKitag.或者坚龙胆G.rigescensFranch.，前3种习称为“龙胆”，后一种习称为“坚龙胆”[2]。龙胆是近200种中成药的重要原料[3]，如龙胆泻肝汤等[4]。

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术。在药用植物的物种鉴定领域，DNA条形码鉴定技术最实际的用途即是对未知样品进行准确鉴定，采用标准化实验流程获得未知样品DNA条形码序列，应用Blast分析、序列比对、建树法、距离法等标准化鉴定流程确保未知样品鉴定的准确性[5-6]。龙胆植物分类复杂，由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给其鉴定带来非常大的困难。目前国内外对龙胆质量、药用价值、药理作用、生物分子遗传多样性等不同领域均有研究。本实验采用DNA条形码技术，对长白山不同地区龙胆植物和药材进行鉴定研究，以期为规范龙胆药材市场、准确鉴别药材来源和资源评价提供参考。

1 材料

1.1 药材

龙胆GentianascabraBunge植株采集于吉林省长白山10个不同地区，共31份，由长春中医药大学药学院齐伟辰副教授鉴定，来源见表1。GenBank下载同属植物ITS2序列10份，见表2。

表1 龙胆样本来源

表2 龙胆属植物ITS2序列

1.2 试剂

无水乙醇、三氯甲烷、氯化钠、盐酸(北京化工厂)；异丙醇、氢氧化钠(天津市兴复科技发展有限公司)；RNase A溶液(10 mg·mL-1，康为世纪生物科技股份有限公司)；溴化十六烷基三甲胺(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙二钠盐(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；溴化乙锭(EB)溶液(上海捷瑞生物工程有限公司)；石蜡油[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 仪器

DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；WD-2105A型微型离心机、DYY-10C型电泳仪、WD-9403F型紫外仪(北京市六一仪器厂)；ETC811型基因扩增仪(苏州东联兴业科学仪器有限公司)；JX-FSTPRP型全自动样品冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司)。

2 方法

2.1 DNA提取

龙胆基因组DNA提取使用冷冻保存的叶片和根，采用改良的CTAB法提取DNA[7]。使用琼脂糖凝胶电泳法及紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度，提取DNA的A260 nm/A280 nm值为1.8～1.9(A表示吸光度)，质量浓度为4.85～6.50 μg·μL-1。

2.2 PCR扩增及测序

正向引物为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。聚合酶链式反应(PCR)体系为20 μL，含PremixTaq10 μL、ddH2O 8 μL、FP(10 μmol·L-1)0.5 μL、RP(10 μmol·L-1)0.5 μL、DNA模板(100 ng·L-1)1 μL。PCR扩增反应步骤为95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，55 ℃，15 s，72 ℃，1 min，40个循环；72 ℃，5 min；40 ℃保存[5]。PCR扩增产物经纯化后进行双向测序，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.3 数据处理

测序结果经Chromas校正，并将序列运用SeqMan软件进行拼接，根据峰图基序列对比，去除质量差的部分，截取了250 bp长度的序列，并将截取的序列在GenBank核苷酸数据库中Blast检索并下载相似度高的龙胆、坚龙胆、笔龙胆、三花龙胆、高山龙胆、条叶龙胆序列。所有候选序列经MEGA 7.0软件自动比对分析碱基之间的差异，计算Kimura 2-parameter (K2P)遗传距离及建立邻接(NJ)聚类进化树分析。聚类分析检测选择Bootstrap方法，重复1000次，鉴定各样本。使Kimura 2-参数型作为氨基酸替代模型。

3 结果与分析

3.1 基于ITS2碱基序列的物种鉴定分析

共10个地区31个龙胆叶片及药材样本琼脂糖凝胶电泳的DNA提取率为100%，ITS2序列扩增成功率为100%，测序成功率为100%，由测序后峰图分析得知，各序列碱基相对分子质量>20，经Blast比对确定31个样本碱基序列为所需鉴定品种。

3.2 种内种间变异分析

龙胆属植物41个样本，经SeqMan处理后，ITS2序列长度为205～210 bp。应用MEGA 7.0软件做序列对比，41个样品中有36个碱基变异位点。其中采集的龙胆样品与GenBank下载的笔龙胆有21个变异位点、与三花龙胆有6个变异位点、与坚龙胆有21个变异位点、与高山龙胆共有19个变异位点、与龙胆均无变异位点。10个不同地区的龙胆之间也没有碱基变异位点，见表3。

表3 基于ITS2碱基序列各龙胆属样本间的碱基变异位点

10个不同地区的龙胆及GenBank下载的龙胆种内遗传距离为0，区分不明显。笔龙胆与同属各龙胆的种间遗传距离为0.09和0.10，三花龙胆与同属各龙胆的种间遗传距离为0.03、0.09和0.10，条叶龙胆与除龙胆外的其他同属龙胆的种间遗传距离为0.09、0.10及0.03，坚龙胆与同属各龙胆的种间遗传距离为0.10、0.12和0.09，高山龙胆与同属各龙胆的种间遗传距离为0.07和0.11，区分明显，见表4。

表4 基于ITS2碱基序列各龙胆属样本间的K2P遗传距离

3.3 NJ树聚类分析

基于41个样本的ITS2序列建立NJ聚类进化树，见图1，可知采集的31个样本和GenBank下载的龙胆及条叶龙胆聚为1支，其他龙胆属各种植物都自聚为1支，其中笔龙胆为1支，三花龙胆为1支，高山龙胆为1支，坚龙胆为1支。可以明显地区分出龙胆属多数不同种植物，虽然具有一定程度上的亲缘关系，但仍然存在差别；同时结合变异位点及K2P遗传距离可清楚发现，条叶龙胆和龙胆应用ITS2碱基序列区分种间差异较小；吉林省长白山10个不同地区的龙胆种内几乎无差异，结合基于ITS2碱基序列变异位点、K2P遗传距离比较、NJ聚类进化树显示得出，吉林省长白山药用植物龙胆为同一种龙胆，无任何差异，鉴别成功率100%。

图1 基于各样本ITS2碱基序列建立的龙胆属植物NJ聚类树

4 讨论

吉林省长白山10个不同地区龙胆叶片和药材的ITS2序列没有显示出明显的地区差异性，这与有效片段长度、取样地的覆盖度、道地药材的性质有关。道地药材从生物学内涵讲是生物学上的居群，其产生除了与药材特定的生态环境和特殊的采收加工技术有关外，还与该道地药材产区内这一物种的地方种群或居群中遗传上的特殊性有关。所以道地药材的一个重要特征就是遗传特征，应将其看作一个具有共同基因库、由交配和亲缘关系联系起来的同一物种的个体群。因此，应用DNA分子遗传标记鉴别方法，结合现代分子生物学手段，通过对遗传信息的分析，能够作为确定药材道地性的手段之一[8-10]。本研究的样本龙胆与从GenBank上下载龙胆的ITS2序列都能较好地区分，种内变异情况几乎不可见。由此可见，运用ITS2序列对龙胆进行鉴别是有效可行且成功率较高的一种分子鉴定方法；本研究也为DNA分子鉴别应用在龙胆科其他属或者其他中药材的鉴别提供了参考。

龙胆属药用植物较多，有龙胆、三花龙胆、条叶龙胆、高山龙胆、坚龙胆等。本研究主要是对吉林省长白山地区药用植物龙胆进行鉴别，提取了长白山10个不同地区的龙胆作对比，结果显示，长白山各地区龙胆序列无差异，鉴定为龙胆；同时比较了龙胆与三花龙胆、条叶龙胆、高山龙胆、坚龙胆等其他各龙胆属植物间的种间差异，龙胆属植物皆有明显区别。理想的DNA条形码要有足够的种间变异和较小的种内差异。DNA分子条形码鉴别方法可以用于龙胆属种间及种内鉴别。从分子生物学角度即基因层面进行研究，比较DNA碱基序列上的差异，不受样品形态限制，减少了人为主观因素影响，使鉴定结果更加准确，从而实现中药鉴定标准化、自动化。