基于药材表征和色谱技术对铁棒锤药材质量标准提升的相关研究△

林丽，高素芳，陈红刚，刘立，晋玲，郭玉环

甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000

铁棒锤异名乌药、草乌、铁牛七、雪上一枝蒿[1]、 八百棒、一枝箭、三转半、榜阿那保[2]等，为毛茛科植物伏毛铁棒锤AconitumflavumHand.-Mazz.或铁棒锤A.pendulumBusch.的干燥块根[3]。其资源分布于甘肃中南大部分地区，陕西、青海、四川、西藏及宁夏等省、自治区亦有分布[4-5]。目前，甘肃永登县武胜驿及天祝县石门为栽培品基地。铁棒锤秋末冬初采挖，除去残茎侧根，削去根头、侧根，自然干燥。其味苦、辛，性温[6]，有大毒[7]。铁棒锤的功效有活血祛瘀、祛风湿、消肿败毒等，治疗腰腿疼、牙痛、风湿性关节炎、毒蛇咬伤等。现代药理学研究表明，铁棒锤具有显著的镇痛作用，还具有局部麻醉、解热、抗炎、致心率失常等作用[8]。根据文献记载，铁棒锤的主要化学成分为生物碱类成分乌头碱(aconitine)、新乌头碱(mesaconitine)、次乌头碱(hypaconitine)[9]、3-乙酰乌头碱(acetylaconitine)、脱氧乌头碱(deoxyaconitine)、苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine)[10]，此类成分既是有效活性成分，也是其毒性成分[11]，其中乌头碱是铁棒锤药材的主要化学成分。

近年来，随着铁棒锤药用价值的不断挖掘，需求量逐年上升，野生资源也遭到不同程度的破坏，导致野生资源量不足。另外，通过第四次全国中药资源普查发现，市场上存在来源不清，品种混用的现象。

中药药用历史悠久，几千年的临床实践表明，中药在某些疾病的治疗上有良好的疗效，而且这种疗效是多种成分协同作用的结果。过去，常以中药中1～2种成分的含量来评价中药的质量，这显然不能代表中药真正的质量。随着分析技术的进步，采用多成分含量测定和指纹图谱相结合的方式来评价中药的质量已成为一种行之有效的方法。新方法与技术的运用可进行定性鉴别，鉴别药材不同的来源、不同的生长期和产区，以及中药成分的组成等；多成分含量测定则可对多个代表性成分进行定量研究；定性与定量相结合能够较全面地反映中药的质量。基于上述现状，甘肃省地方药材标准急需重新提升，以规范市场、确保临床用药安全，保证药效。本研究以不同批次铁棒锤为研究对象，采用植物分类方法进行综合分析，确定铁棒锤药材名称和对应的基原植物，比较其区别。同时运用薄层色谱及HPLC色谱等技术，以乌头碱为检测指标，建立快速检测手段，为规范药材质量、保证临床疗效提供参考。

1 材料

1.1 仪器

WFH-201B型紫外反射仪(上海精科实业有限公司)；LC-16型高效液相色谱仪岛津；UV-2600型微量紫外分光光度计(日本岛津公司)；KH-5300B型超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)；BS 224 S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；101-2型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；HH-4型数显恒温水浴锅(江苏金坛市环宇科技仪器厂)；RE-52AA型自动旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DJ-02型中药粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)。

1.2 试药

乌头碱对照品(上海原叶生物科技有限公司，批号：P17D7F27141，纯度≥98%)；四氢呋喃(天津市大茂化学试剂厂)和乙腈(赛默飞公司)为色谱纯；乙醚、三氯甲烷、氨试液、氢氧化钠、磷酸二氢钠、溴麝香草酚蓝均为分析纯(天津大茂公司)。

16批次铁棒锤样品分别采购于甘肃天祝、永登，陕西宝鸡、太白山，宁夏六盘山，四川阿坝州，贵州凯里等地和四川荷花池、河北安国、广西玉林药市。具体信息见表1。经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为毛茛科植物伏毛铁棒锤AconitumflavumHand.-Mazz.或铁棒锤A.pendulumBusch.的干燥块根的干燥块根。

表1 铁棒锤药材样品信息

2 方法与结果

2.1 性状及显微鉴定

采用植物分类方法进行综合分析，确定铁棒锤药材名称和对应的基原植物，比较其区别。

2.1.1性状 本品母根呈圆锥形或圆柱形，两端微尖，长1.5～8.0 cm，直径0.5～1.5 cm；表面灰褐色，有稍扭曲的纵沟纹，有时粗皮脱落露出浅黄色内皮；顶端有茎痕及侧根痕；质轻，断面常有裂隙，可见类圆形或多角形的环纹。子根长纺锤形，长2.0～5.5 cm，直径0.6～2.0 cm；表面有细纵纹及明显的须根痕，饱满；顶端有芽痕及主根痕；断面粉性，亦有角质者。气微，味涩、苦而麻舌。褐色，子根较多(2～4个)，见表2。

表2 铁棒锤药材栽培品与野生品性状比较

2.1.2横切面 伏毛铁棒锤：后生皮层为1～2列切向延长形状不规则的黄棕色细胞，微木栓化。皮层较窄，由4～8列切向延长的类长方形薄壁细胞组成，内皮层清晰可见。韧皮部宽广，约占横切片的2/3，由类圆形或多角形的薄壁细胞组成，薄壁细胞中含有大量淀粉粒，筛管群散布其中，周围具有韧皮纤维，近形成层较密集。形成层由1～2列细胞构成，为五边或多边形的星状，有时环形，细胞呈类长方形或多角形，切向延长。木质部的导管位于形成层角隅的内侧，维管束排列成U字形或辐射状，中央时有中空。铁棒锤子根形成层环通常呈圆形，韧皮部有石细胞。母根形成层环通常为5～6边形，韧皮部有少量石细胞或无。见图1。

野生品：同栽培品，形成层褐色，有时断裂，中央常形成空洞。见图2。

2.1.3粉末 栽培品：灰白色，淀粉粒众多，单粒主要为类圆形、多角形或盔帽状，直径约2～6 μm，复粒多由 2～7 粒组成。脐点明显，多呈叉状。导管多为网纹导管，稀环纹，螺纹，直径 10～36 μm。纤维呈线形，两端稍尖，壁孔明显。后生皮层细胞呈棕色或棕黄色，表面观呈类方形或长多角形，垂周壁稍厚，呈不规则波状弯曲。石细胞未见，并可见少量棕色团块。

野生品：灰白色发黄，淀粉粒众多，单粒主要为类圆形、多角形或盔帽状，直径约2～6 μm，复粒多由 2～5粒组成。脐点明显，点状或叉状。导管多为网纹导管，稀环纹，螺纹，直径 20～36 μm。纤维呈线形，两端稍尖，壁孔明显。后生皮层细胞呈棕色或棕黄色，表面观呈类方形或长多角形，垂周壁稍厚，呈不规则波状弯曲。石细胞少见，并可见少量棕色团块。见图3。

注：1.后生皮层；2.皮层；3.内皮层；4.韧皮部；5.木质部；6.形成层；7.髓部；8.筛管群。图1 铁棒锤栽培品横切面

注：1.后生皮层；2.皮层；3.内皮层；4.筛管群；5.韧皮部；6.木质部；7.髓部。图2 铁棒锤野生品横切面

注：1.淀粉粒；2.导管；3.石细胞；4.薄壁细胞(内含淀粉粒)；5.后生皮层；6.棕色块。图3 铁棒锤(根)粉末图(10×40)

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1供试液的制备 取不同批次药材，粉碎，过80目筛，精密称取5 g，置100 mL具塞三角瓶中，加乙醚-三氯甲烷(3∶1)混合溶液35 mL，使之润湿，混匀，再加入氨试液3 mL，摇匀，低温(低于40 ℃)超声提取1 h，静置10 min，滤过，弃去药渣，滤液低于40 ℃回收溶剂，残渣用甲醇移至10 mL量瓶中定容，浓缩至 1 mL，作为供试品溶液。

2.2.2对照品溶液的制备 乌头碱对照品分别加甲醇制成3 mg·mL-1的乌头碱溶液，作为对照品溶液。

2.2.3薄层色谱条件 用0.03 mm的毛细管吸取供试品溶液与乌头碱对照品溶液各5 μL，点于同一氨气饱和后的硅胶GF254(20 cm×10 cm)薄层板上，使用环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(8∶1.5∶1)为展开系统，展开，取出，晾干，在254 nm紫外灯下观察。

2.2.4薄层色谱鉴定结果 从图4可以看出，14批次不同产地铁棒锤与对照品在相同位置上显相同颜色(深铅灰色)的斑点，计算其比移值(Rf)。得出该系统可稳定分离铁棒锤中的成分，比较不同产地样品在相同Rf部位的斑点大小，颜色深浅，表现不一，在点样量一致的条件下可反映出不同产地间各类成分含量有差异，故通过薄层色谱可以快速地鉴别。

注：S1～S14.14批次铁棒锤样品；a.乌头碱对照品。图4 14批次铁棒锤薄层色谱图

展距为7.7 cm，Rf对照品=0.376。

Rf1=0.376 Rf2=0.364 Rf3=0.364 Rf4=0.357 Rf5=0.355 Rf6=0.361 Rf7=0.364

Rf8=0.364 Rf9=0.365 Rf10=0.364 Rf11=0.370 Rf12=0.370 Rf13=0.376 Rf14=0.370

2.3 紫外-可见分光光度法含量测定

2.3.1缓冲溶液的配制 pH 7.6缓冲溶液的配制：取0.l mol·L-1的NaOH溶液427.4 mL和0.1 mol·L-1的NaH2PO4溶液500 mL置于1000 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度。

pH 7.6的0.000 2 mol·L-1溴麝香草酚蓝缓冲溶液的配制：精密称取0.062 5 g溴麝香草酚蓝加pH 7.6缓冲溶液500 mL使溶解，即得。

2.3.2乌头碱对照品溶液的配制 精密称取乌头碱对照品3.6 mg，置50 mL量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容至刻度，备用。

2.3.3供试液的制备 分别精密称取16批次铁棒锤粉末1.000 g，置于具塞三角烧瓶中，分别加1 mL氨水，摇匀，放置30 min，再加20 mL三氯甲烷，放置过夜，滤过，药渣用三氯甲烷洗3次(每次5 mL)，滤液合并，浓缩，定容于25 mL量瓶中，即得。

2.3.4含量测定方法 精密吸取2.3.3项下供试液6 mL于分液漏斗中，加6 mL溴麝香草酚蓝缓冲溶液用力振摇1 min，倾入分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷层，在415 nm处测定吸光度。

2.3.5专属性 按照2.3.4项下含量测定方法对供试液、对照品及空白对照品分别进行萃取，所得三氯甲烷层溶液在190～800 nm进行扫描，专属性良好，结果见图5。

注：1.乌头碱对照品；2.铁棒锤样品(S2)；3.空白溶剂。图5 乌头碱对照品、供试品、空白对照品UV图

2.3.6标准曲线的制备 精密吸取2.3.2项下乌头碱对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于25 mL的具塞试管中，分别加溴麝香草酚蓝缓冲溶液和6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL三氯甲烷6 mL，用力振摇1 min，倾入分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷层，以0号为空白，在415 nm处测定吸光度，以乌头碱含量为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)得乌头碱回归方程为Y=20.957X+ 0.254 5，r=0.999。结果表明，乌头碱在0.012～0.072 mg·mL-1呈现良好的线性关系。

2.3.7方法学考察

2.3.7.1精密度试验 取同一供试品(S2)溶液6 mL，采用2.3.4项下的含量测定方法连续测定吸光度6次，测得总生物碱吸光度的RSD为0.37%，表明仪器精密度良好。

2.3.7.2重复性试验 取同一批号样品(S2)6份，各1 g精密称定，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，采用2.3.4项下的含量测定方法，测得总生物碱吸光度的RSD为0.37%，表明该方法重复性良好。

2.3.7.3稳定性试验 取同一份供试品(S2)溶液，采用2.3.4项下的含量测定方法，分别于0、10、20、30、40、50 、60 min测定，测得总生物碱吸光度的RSD为0.26%，表明供试品溶液在1 h内稳定性良好。

2.3.7.4加样回收率试验 取已知含量的铁棒锤粉末约1 g，共5份，精密称定，按照2.3.3项下供试品溶液的制备方法操作，精密量取4 mL，分别加入2.3.2项下乌头碱对照品溶液2 mL(0.072 mg·mL-1)和溴麝香草酚蓝缓冲溶液6 mL，用力振摇1 min，倾入分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷层在415 nm处测定吸光度，计算平均加样回收率为99.57%，RSD为1.65%。结果见表3。

表3 乌头碱加样回收率试验结果(n=5)

2.3.8样品含量测定 取16批铁棒锤药材各3份，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，运用2.3.4项下的含量测定方法测定吸光度。测定结果见表4。

表4 16批次铁棒锤样品中总生物碱含量测定结果(n=3)

2.4 HPLC含量测定

2.4.1色谱条件 色谱柱为ZORBAX Edipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙睛-四氢呋喃(25∶15)为流动相A，0.1 mol· L-1乙酸铵溶液(每1000 mL加冰乙酸0.5 mL)为流动相B，梯度洗脱(0～48 min，15%～26%A；48～48.1 min，26%～35%A；48.1～58 min，35%A；58～65 min，35%～15%A)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量10 μL；检测波长为235 nm；理论塔板数≥4000。乌头碱与相邻峰分离度均大于1.5，分离度良好。

2.4.2对照品溶液制备 精密称取乌头碱对照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，待完全溶解后定容，摇匀。其乌头碱质量浓度为0.5 mg·mL-1。

2.4.3供试品溶液制备 取16批次铁棒锤样品粉末，过80目筛。各精密称取2.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加35 mL乙醚-三氯甲烷(3∶1)混合溶剂及3 mL氨试液，摇匀，低于40 ℃超声提取1 h，静置10 min，取上清液，过滤，低于40 ℃回收溶剂，残渣用甲醇移至10 mL量瓶中定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4.4线性关系考察 取2.4.2项下对照品溶液，分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL量瓶中，分别用甲醇定容，摇匀，配制成系列质量浓度对照品溶液，分别进样10 μL，按2.4.1色谱条件测定，以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得乌头碱回归方程Y=1×107X-47 616(r=0.999 9)结果表明，乌头碱在0.025～0.500 mg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.5方法学考察

2.4.5.1精密度试验 取同一供试品(S2)溶液，在2.4.1项色谱条件下连续进样6次，测得乌头碱峰面积的RSD为2.28%，表明仪器精密度良好。

2.4.5.2重复性试验 取同一批次样品(S2)6份，各2.5 g精密称定，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，在2.4.1项下色谱条件下进样，测得乌头碱峰面积的RSD为2.53 %，表明该方法重复性良好。

2.4.5.3稳定性试验 取同一供试品溶液，在2.4.1项下色谱条件中，分别于0、2、4、8、12、24 h进样6次，测得乌头碱峰面积的RSD为2.43 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5.4加样回收率试验 取已知含量的铁棒锤粉末约2.5 g，共6份，精密称定，分别加入等量的对照品，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，在2.4.1项下色谱条件下进样，计算加样回收率，结果见表5。

表5 铁棒锤中乌头碱加样回收率试验结果(n=6)

2.4.6样品含量测定 取16批次样品各3份，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件分别进样测定，结果见表6，HPLC图见图6。

表6 16批铁棒锤样品中乌头碱含量测定结果(n=3) mg·g-1

以乌头碱为参照物，确定了5个特征峰，方法学精密度、稳定性、重复性试验详实度偏差均小于3%，16批药材特征图谱相似度均大于0.95。乌头碱质量分数≥0.5%。

注：S1～S16.16批铁棒锤样品；对照品为0.5 mg·mL-1乌头碱溶液；空白为甲醇。图6 16批铁棒锤样品HPLC图

3 结论与讨论

《甘肃省中药材标准》2009年版只是在铁棒锤药材基原、性状、显微及水分、灰分上做了要求。随着铁棒锤药用价值的不断发现及临床产品开发的需要，仅限于简单的标准已经无法满足市场及其质量评价需求，因此，展开铁棒锤质量标准提升势在必行。其中，在新的标准中加入了薄层色谱方法、紫外分光光度法、以乌头碱为主成分指标的HPLC及指纹图谱，为今后其质量控制提供科学依据。

本实验对比16批铁棒锤药材性状表征，发现野生铁棒锤整体子根个体偏小、块根干瘪、栽培个体较大，断面形成层五角>90°或圆形。

HPLC分析显示，16批铁棒锤药材中都含有乌头碱。S9的乌头碱含量明显高于其他批次，S9的药用部位为子根，而其他批次的药用部位为块根。另外是否与其为主产区域有关，有待于后期进一步探讨。不同产地批次、不同资源类型的总生物碱含量差异较大，其中S1、S11、S12、S13样品为野生品，其总生物碱含量明显高于其他12批栽培品的含量，也同时验证了在环境胁迫下代谢产物累积的增加。建议在炮制铁棒锤药材时应区分用药部位和药材资源类型，块根与子根分别炮制，野生品与栽培品分别炮制。

薄层色谱条件的选择：乌头碱薄层鉴别时曾用乙醚-乙酸乙酯(氨蒸气饱和)、环己烷-乙酸乙酯-二乙胺、乙酸乙酯-正己烷-95%乙醇等不同比例的展开系统，结果发现，环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(8∶1.5∶1)为展开剂，点样前用浓氨气饱和硅胶GF254板薄层板30 min，再置254 nm紫外灯下观察，斑点显色清晰，此方法简便易行、斑点分离度好、清晰，可用于铁棒锤药材的快速定性鉴别。

紫外-可见分光光度法条件的选择：经过反复条件探索2.3.3项下的供试品溶液制备方法简单易行，全波长扫描后确定415 nm为总生物碱的最大吸收波长。此方法具有简单易行、重复性好、设备操作简单等特点，可用于其快速含量测定。

含量限度确定：考察了16批铁棒锤药材，乌头碱和总生物碱含量差异较大，乌头碱质量分数为0.575～1.830 mg·g-1，平均质量分数为0.956 mg·g-1；总生物碱质量分数为1.268～12.071 mg·g-1，平均质量分数4.728 mg·g-1。故应以最低测定值设限，可确定铁棒锤中乌头碱限度应≥0.575 mg·g-1，总生物碱限度应≥1.268 mg·g-1，用于控制该药材质量。

HPLC色谱条件的选择：考察了乙腈-水(0.2%二乙胺)、乙睛-四氢呋喃(25∶15)-水(0.1 mol·L-1醋酸铵溶液，1000 mL加冰醋酸0.5 mL)不同检测波长对HPLC图的影响，结果表明，以乙睛-四氢呋喃(25∶15)为流动相A，以0.1 mol·L-1乙酸铵溶液(每1000 mL加冰乙酸0.5 mL)为流动相B为最优流动相，在2.4.1项色谱条件下，化合物分离效果最好。

在市场调查时发现，有很多乌头类药材相互混用，如工布乌头、高乌头、短柄乌头、祁连山乌头和黄花乌头，因此在基原上要注意鉴别。