以重组无乳链球菌GapC1-150 作抗原的牛血清抗体间接ELISA 检测方法建立

刘硕，王欣，李皖豫，马骏，范钊伟，王然，段旭阳，周玉龙，朱战波，崔玉东，

（1.黑龙江八一农垦大学生命科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

奶牛乳腺炎主要是由细菌感染乳腺而引起，该病是影响世界各国奶牛业发展的最重要疾病之一，不仅给奶业和奶牛养殖业造成巨大经济损失，还影响人类健康。引起奶牛乳腺感染的细菌种类繁多，主要有链球菌、葡萄球菌和肠道菌感染等[1]。链球菌中主要包括无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌。其中在临床病例样本中，仅无乳链球菌的分离比率有时就可占到所有分离病原菌的38.61%[2-3]。以往对链球菌引起的奶牛乳腺炎主要使用抗生素预防和治疗，但随着抗生素的长期、大量使用，链球菌的耐药性日益严重，耐药菌株大量增加[4]。于是，研究和使用疫苗预防链球菌引起的奶牛乳腺炎备受重视。在上个世纪70 年代，人们就研究了用自家菌苗预防无乳链球菌感染奶牛乳腺，但免疫保护效果不理想[5]。2002 年Fontaine MC 等[6]研究了乳房链球菌和无乳链球菌表面关联的GapC 重组蛋白或嵌合CAMP-3蛋白免疫接种奶牛，证明了GapC 比CAMP-3 诱导更明显的抗病原攻击的免疫保护作用。随后，Bolton A等[7]用停乳链球菌表面蛋白GapC 和Mig 重组蛋白分别免疫牛，证明GapC 和Mig 免疫牛均能明显降低乳中体细胞数，且GapC 较Mig 免疫牛的乳区感染数明显降低。

链球菌GapC 是具有GAPDH 酶活性的保守性蛋白，且可能与其粘附和感染有关[8]。通过基因序列分析可知，无乳链球菌GapC 与停乳链球菌、乳房链球菌的GapC 的核苷酸序列具有高度的同源性分别[9]。课题组用奶牛乳房炎无乳链球菌GapC、停乳链球菌GapC、乳房链球菌GapC 的重组蛋白分别免疫小鼠，证明该蛋白具有良好的交叉免疫保护作用，即一个GapC 免疫可使小鼠获得对无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌三种菌的抗感染免疫保护作用[10]。进一步研究证实GapC1-150能诱导与GapC 全蛋白一致的免疫保护作用[11]。目前，由链球菌GapC1-150重组蛋白构建的融合蛋白GIT 作为预防链球菌性奶牛乳房炎的候选疫苗正在进行奶牛临床试验，但对该疫苗免疫接种奶牛产生的抗体缺少检测方法，无法有效地评价GIT 抗原诱导的体液免疫应答。

临床上用于抗体水平检测的方法有凝集试验、沉淀试验、中和试验以及ELISA 标记抗体等检测方法[12]，而其中间接ELISA 检测方法具有特异性好、灵敏性高、简便快捷、适于大规模和定量检测等优点。因而，实验拟选择重组无乳链球菌GapC1-150蛋白作为抗原，建立血清抗体间接ELISA 检测方法。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和血清

无乳链球菌HLJ57 株，为实验室分离于患奶牛乳房炎牛乳汁、经鉴定保存的菌株；大肠杆菌BL21（de3） 株为实验室保存菌株；质粒pET32a、质粒pGEX-6p-1 为实验室保存；金黄色葡萄球菌Wood46株血清、金黄色葡萄球菌重组IsdB、Trap、pET32a 标签蛋白以及含有链球菌GapC1-150片段的GIT 融合蛋白血清由实验室制备保存；牛布氏杆菌病阳性血清、牛副结核阳性血清和大肠杆菌腹泻牛血清以及待检牛血清样本由黑龙江八一农垦大学动物传染病实验室提供。

1.1.2 主要试剂

预染彩虹蛋白Marker 购自Thermo 公司；Hisbinding-resin 蛋白纯化柱、GST·bind 树脂为上海点创生物科技有限公司、Super-Bradford 蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自北京Solarbio 公司；小鼠抗GST Taq 抗体购自Proteintech 公司、小鼠抗His Taq 抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗牛IgG 购自北京博奥森有限公司；NC 膜、TMB 显色液购自北京Solarbio 公司。Luminata Crescendo Western HRP substrate 购自哈尔滨纳川有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组无乳链球菌CapC1-150的表达、鉴定和纯化

使用上游引物5′-CGCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3′、下游引物5′-CACAAGCTTAGCACCTGAGATAACTGTT-3′，以无乳链球菌基因组提取物为模板进行PCR 扩增，获得的CapC1-150基因片段分别与pET32a 质粒和pGEX-6P-1 质粒连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经酶切和基因测序鉴定正确后，在含有氨苄抗性的液体培养基中加终浓度0.1 mM 的IPTG 诱导表达4 h，收集菌体进行SDS-PAGE 分析。同时，将电泳后的凝胶转移至PVDF 膜上，用抗标签抗体作为第一抗体，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 抗体作为第二抗体，进行Western-blot 鉴定。用His-binding-resin 蛋白纯化柱纯化由pET32a 载体表达的CapC1-150蛋白（简称eCapC1-150）及pET32a 标签蛋白，用GST·bind树脂纯化pGEX-6p-1 载体表达的GapC1-150蛋白（简称gCapC1-150）。由eCapC1-150蛋白和标签蛋白pET32a用于疫接种奶牛制备血清；由gCapC1-150蛋白作为间接ELISA 检测抗原。

1.2.2 抗原免疫血清制备

选择6~18 月龄的健康Holstein 育成牛，用e－CapC1-150蛋白、pET32a 标签蛋白和培养7 h 的福尔马林灭活的无乳链球菌HLJ57 分别与弗氏完全佐剂按体积比1∶1 比例乳化后，采用脖颈部肌肉或臀部肌肉注射方式，每头牛注射蛋白抗原1.5 mg 或全菌体3×1010cfu。初次免疫后3 周，以等量的抗原与弗氏不完全佐剂乳化后再次免疫接种牛。同时以PBS 与佐剂乳化后免疫牛，用于制备对照血清。于二次免疫10 d 后尾静脉采血，制备血清。

1.2.3 间接ELISA 操作程序

间接ELISA 操作的具体操作步骤[13]，先将抗原用包被液稀释后进行包被，再用封闭液封闭，然后加入待检血清，孵育后加入酶标二抗，最后加入酶底物、终止液，测定OD450值。 每个步骤之间均用洗涤液洗涤3 次，每次洗涤4 min。每种试剂均加入每空100 μL。在OD450值阳性与阴性比值（P/N）大于2.1 以上、且最大者的反应条件作为确定ELISA 最佳反应条件的判定依据。

1.2.4 抗原、血清最佳稀释浓度确定

将gGapC1-150蛋白作为抗原，以包被缓冲液进行倍比稀释，分别稀释成5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1；抗原eCapC1-150阳性血清和对照牛血清以样品稀释液进行稀释，分别稀释成1/500、1/1 000、1/2 000 、1/4 000。

1.2.5 间接ELISA 条件的优化

以最佳抗原浓度进行包被，分别用包被液碳酸盐缓冲液CBS（pH 9.6）、Tris 盐缓冲液TBS（pH 8.6）、磷酸盐缓冲液PBS（pH 7.4）、PBS 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）、柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）、水（pH 7.0）稀释抗原蛋白，包被时间暂为37 ℃2 h；确定包被液后，再以最佳包被液于4 ℃过夜、4 ℃过夜加37 ℃1 h、37 ℃2 h、37 ℃1 h、37 ℃45 min、37 ℃30 min 进行包被。在以上优化基础上，优化不同封闭液，所用封闭液分别为1%BSA、5%脱脂乳、1%BSA+5%蔗糖、1%BSA+0.05%Tween20、5%脱脂乳+0.05%Tween20、5%胎牛血清、1%明胶，封闭时间暂为37 ℃2 h；封闭液确定后再优化封闭条件，分别以37 ℃2 h、37 ℃1.5 h、37 ℃1 h、37 ℃45 min、37 ℃30 min、37 ℃15 min 封闭。在以上优化反应条件完成后，反应体系分别加入阴、阳性血清进行反应时，将反应时间分别设为15、30、45 min，1、1.5、2 h。

1.2.6 Cut-off 值确定

取阴性对照牛血清52 份、GIT 免疫牛血清17 份，用优化后的条件进行间接ELISA 检测，每一个样品重复3 次，求得两类血清的OD450平均值、标准差（SD）。对阴性血清与免疫血清OD450值进行正态分布和ROC曲线分析后，根据cut-off 值定值原则进行确定[14]。

1.2.7 特异性与敏感性确定

用优化后的间接ELISA 方法分别对GIT、IsdB、Trap、pET32a 和金葡菌Wood46、无乳链球菌HLJ57免疫牛血清以及大肠杆菌腹泻牛血清、牛副结核阳性血清、牛布氏杆菌阳性血清等进行检测，根据确定的cut-off 判定结果，以评估该方法的特异性。

将阳性与阴性血清进行平行倍比稀释至1∶128 000，同时用缓冲液PBS 作为空白对照组。以P/N＞2.1 的最大稀释度来判定间接ELISA 方法的敏感性[15]；当OD450值小于cut-off 值的稀释度为该ELISA方法的最低检测水平[16]。

1.2.8 稳定性检测

用同一次纯化的gGapC1-150抗原包被酶标板，在3 个不同的时间内测定6 份不同的血清（每份血清6次重复），并计算批内变异系数，确定批内稳定性；用不同次纯化的抗原包被3 块不同批次酶标板，在相同的时间测定6 份不同的血清（每份血清6 次重复），并计算批间变异系数，确定批间稳定性。

1.2.9 临床样品检测

用建立的间接ELISA 方法检测待检牛血清85份。其中，待检牛血清样本来源于鸡西某牛场19 份，虎林某牛场15 份，北安某牛场12 份，明水某牛场26份，阿荣旗某牛场13 份。

1.2.10 数据处理分析

用EXCEL2003 和SPSS Statistics 17.0 软件处理、分析数据，用Origin2018 软件作图。

2 结果与分析

2.1 重组GapC1-150 蛋白的表达、鉴定及纯化

从S.agalactiae HLJ57 菌株PCR 扩增获得的gapC1-150基因，与GenBank 中的基因序列（GI：21666-598）进行比较，结果同源性为100%。用IPTG 诱导表达后，重组蛋白eCapC1-150和gGapC1-150分别在36、44 KDa 处出现蛋白质条带，并分别用抗His-tag、抗GST 抗体进行免疫印迹验证；重组蛋白eCapC1-150存在于菌体破碎后的上清和沉淀中；而重组gGapC1-150主要存在于菌体破碎后的沉淀中，且两个重组蛋白均得到较好纯化。结果详见图1（A-D）。

2.2 最佳包被抗原浓度与血清的稀释度确定

用方阵法以不同浓度的包被抗原与不同稀释度的阴、阳血清做间接ELISA，测定OD450值，求P/N值。当抗原包被浓度为2.5 μg·mL-1、血清稀释1/1 000时，P/N 值最大。结果详见表1。

图1 重组蛋白GapC1-150 表达、鉴定及纯化Fig.1 Expression，identification and purification of the recombinant GapC1-150

表1 包被抗原浓度与血清稀释度滴定（P/N）Table 1 Titration of coated antigen concentration and serum dilution（P/N）

2.3 间接ELISA 反应条件优化

经间接ELISA 检测，6 种包被液中，PBS（pH7.2）的P/N 值最大；包被时间为37 ℃45 min 时P/N 值最大；7 种封闭液中，1% BSA（PBST）的P/N 值最大，封闭时间以37 ℃1.5 h 时P/N 值最大；抗原与血清孵育时间以37 ℃30 min 时P/N 值最大。以上结果确定为间接ELISA 最佳反应条件。

2.4 Cut-off 值确定

对52 份阴性牛血清和17 份GIT 免疫血清的OD450值正态分布和ROC 曲线分析，两组血清OD450值均符合正态分布，且置信区间大于95%，阴性牛血清与GIT 免疫血清OD450值不发生重叠，因此以2 倍的阴性血清OD450平均值作为cut-off 值，即平均值0.231 9，cut-off 值为0.464。结果详见如图2、3。

2.5 特异性与敏感性确定

用建立的ELISA 检测方法分别对重组eGapC1-150、GIT、IsdB、Trap、pET32a、金葡菌Wood46、无乳链球菌HLJ57、大肠杆菌腹泻牛血清、牛副结核阳性血清、牛布氏杆菌阳性血清进行检测。结果显示，gGapC1-150作为包被抗原所建立的间接ELISA 检测方法，检测到eGapC1-150蛋白免疫血清、GIT 免疫血清阳性，其他血清均呈阴性，说明与其他血清无交叉反应。结果详见图4。

图2 对照血清、免疫血清用ELISA 进行评估Fig.2 Evaluation of the control serum and immune serum using ELISA

图3 ELISA 的cut-off 值确定Fig.3 Determination of cut-off value of ELISA

图4 ELISA 的交叉反应性Fig.4 Cross reactivity of ELISA

将阳性血清、阴性血清分别倍比稀释至1∶128 000倍，进行间接ELISA 检测。结果显示，该ELISA 方法的敏感度为1∶16 000；最低可检测血清稀释度1∶64 000，且当血清稀释度为1∶1 000 时，阴性值刚好低于cutoff 值，也进一步说明了最佳血清稀释度的准确性。结果如图5。

图5 ELISA 检测的最低血清稀释度Fig.5 The minimum detection limit of ELISA

2.6 稳定性确定

用同批次抗原和试剂在3 个不同的时间内对6份不同的血清进行重复性检测，其批内变异系数在3.6%~9.6%之间；用不同批次抗原和试剂同时对6 份不同的血清进行重复性检测，其批间变异系数在1.59%~9.81%之间。变异系数均小于10%，说明该ELISA 法稳定性良好。

2.7 临床样本检测结果

用建立的间接ELISA 检测方法85 份待检牛血清进行了检测，结果待检牛血清阳性检出率为12.94%。

3 讨论

临床上用于检测血清抗体水平的方法有抗原凝集试验、沉淀试验、中和试验以及ELISA 标记抗体等检测方法[12]，其中间接ELISA 检测方法由于具有特异性好、灵敏性高、简便快捷、适于定量和大规模检测等优点，已广泛应用于临床检测及疫苗免疫效果评价。根据实验前期研究的含有链球菌GapC1-150的融合蛋白疫苗临床免疫奶牛后检测抗体水平需要，实验建立了以gGapC1-150作为包被抗原的间接ELISA检测方法，通过对反应条件优化、特异性、敏感性等研究，证明所建立的间接ELISA 方法，具有较好的特异性和敏感性。

在实验设计上，我们使用eGapC1-150免疫奶牛制备阳性血清。为了避免标签蛋白pET32a 在检测时可能带来的交叉反应，选用pGEX-6p-1 载体表达的GapC1-150作为检测抗原，对eGapC1-150免疫血清和GIT 免疫血清检测均呈阳性，而与pET32a 免疫血清和其他pET32a 表达抗原的免疫血清均呈阴性，说明很好地避免了表达标签蛋白的交叉反应。但对两次灭活无乳链球菌HLJ57 免疫血清检测为阴性，可能与GapC 在细菌中的表达量占菌体全蛋白量过低所造成的；另外，对3 份金黄色葡萄球菌的Trap 抗原免疫血检测的OD450值则与Cut-off 值相近，且有1 份血清的OD450值高于Cut-off 值，其原因有待于进一步研究。

在使用52 份阴性牛血清、17 份GIT 免疫牛血清检测确定cut-off 值时，我们经过SPSS 软件分析对照血清及GIT 免疫血清均符合正态分布，且置信区间大于95%，通过Origin 软件对对照血清、免疫血清多因子柱状图2 可知，对照血清与GIT 免疫血清之间不交叉，故此cut-off 值采用传统定值法即cutoff 等于2X（对照样品平均值），即0.464。根据ROC曲线分析和特异性、敏感性检测，该检测方法特异性强、敏感性好。有研究者[17-18]在建立间接ELISA 检测方法时，先对阴性血清进行筛查，剔除OD450值偏高的血清，然后再对血清进行检测，确定Cut-off 值。在没有确定是由感染造成的情况下，如果是牛个体差异或一些非特异性因素造成的，还是应该把这份血清纳入统计计算之中，这样得出cut-off 值可能更符合实际。但实验的阴性牛血清和免疫牛血清样本数较小，有待于在今后临床检测中对结论作进一步补充、修正。

用建立的间接ELISA 检测方法对85 头待检牛血清样本中，检出了11 头阳性牛，但对于这些血清样本来源的奶牛具体情况不够了解，无法查清阳性结果的原因[19-20]。由于对GapC450免疫血清尚缺少可参考的检测方法，无法对检测结果进行复核[21-23]，如果能够再进一步开展研究的话，应该对试验牛的来源、健康状况进行详细调查和严格检查，在实验造作的各个环节都做到确实可靠；或者建立探讨其他检测方法进行比较检测，从而时所建立的方法在实践应用中达到理想效果。

4 结论

用表达的重组蛋白gGapC1-150作为检测抗原，建立了间接ELISA 血清学检测方法，通过反应条件优化、交叉血清反应检测、阳性血清不同稀释度测定以及对GapC1-150融合蛋白GIT 疫苗免疫牛血清检测等证明，所建立的间接ELISA 牛血清GapC1-150抗体检测方法特异性强、敏感性高、稳定性良好，适于含链球菌GapC1-150片段的GIT 疫苗免疫牛血清检测。