绿豆芽多酚工艺的优化及抗氧化活性的研究

梁雪梅，林欣梅，曹家宝，魏美霞，曹龙奎，李志江，4，鹿保鑫，4

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心；3. 黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室；4.黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心）

绿豆[1]又名青小豆、植豆，是一种富含蛋白质、碳水化合物、淀粉及多种矿物质的功能性杂粮豆类，具有清热解毒、延缓衰老、消暑养颜的食用价值。除此之外，绿豆还有降血糖[2]、降血脂[3]、降压抗癌[4]、保护肝脏[5]及调节机体免疫力[6]的功能特性，这些可能与绿豆本身具有的生物活性化合物有关，尤其是绿豆中的酚类、黄酮类物质[1]。有研究发现，豆类在发芽后，化学组成、营养价值和风味会发生明显变化[7-8]。李晓红等[9]现芽苗在生长过程中维生素、γ-氨基丁酸（GABA）、酚类和黄酮类物质含量均有显著的增加，且表现出良好的抗氧化活性。

多酚类化合物是一种具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、清除体内自由基等功效的活性物质[10]。由于能够限制氧自由基及一些还原性氧化合物，因此可以预防和治疗一些与免疫力低下的相关疾病，比如多酚对预防乳腺疾病、癌症、糖尿病、防止骨质疏松具有很好的作用[10-11]。目前，多酚化合物在石榴皮[12]、玉米须[13]、豆类[14]、蚕豆[15]等物质中已有广泛研究。也有研究证实豆类中的黄酮类和酚类中特有的植物雌激素对延缓更年期、保护卵巢，预防乳腺疾病有显著的效果[16-17]。

目前常见的多酚提取方法有溶剂法[18]、超声波辅助法[19]、微波辅助法[20]、酶法[21]和超声微波辅助法[22]。超声微波辅助法[23-24]将超声波良好的空化作用与微波的热效应相结合，可以有效破坏原料的细胞壁，加速溶剂扩散及溶质的流出，克服了常规方法中的萃取不足，相对于其他提取方法操作简便的同时还能够更好地保护提取物的结构。蒋志国[25]和阎海青[26]等利用超声-微波辅助法分别提取菠萝蜜果皮及蓝莓中的多酚化合物，提取多酚化合物含量高、抗氧化活性良好。目前有关多酚的研究多数是针对绿豆中的，而对绿豆芽多酚的研究还相对较少，尤其是在提取工艺上的研究，更是未见报道[27]。绿豆在发芽后酚类物质会显著增加，所以如何有效地提取绿豆芽中的多酚类物质并在提取过程中保持其生物活性就变得尤为重要。根据前期试验结果发现绿豆芽在芽长4~5 cm 时多酚含量最高且具有良好的抗氧化活性，因此研究以4~5 cm 芽长的绿豆芽作为优化提取工艺的试验原料，利用超声微波协同萃取技术提取绿豆芽中的多酚物质，以单因素为基础，进行响应面优化分析处理，在优化试验的基础上，考察优化提取工艺后绿豆芽多酚的体外抗氧化活性，为以后绿豆芽中多酚物质的保留和绿豆芽营养产品的开发提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

绿豆，山西大同小明；甲醇、乙醇、无水碳酸钠，均为分析纯，购自辽宁泉瑞试剂有限公司；福林酚试剂、没食子酸标准品、维生素C 标准品，均为分析纯，购自Sigma 公司。

CB-AS-323B 型康丽豆芽机，佛山市顺得区嘉壕实业有限公司；AR323CN 电子天平，青岛明博环保科技有限公司；DGG-9023A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；SE-750 型高速粉碎机，永康市艾泽拉电器有限公司；RE52-99 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；CW-2000 超声-微波协同萃取仪，南京以马内利仪器设备有限公司；TDZ5-WS 低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TU-1810 型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

利用发芽机将绿豆进行发芽处理后筛选出芽长4~5 cm 的绿豆芽，去离子水洗净后于45 ℃鼓风干燥机中烘干至恒重，粉碎机粉碎过筛，得到80 目绿豆芽粉真空包装于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 绿豆芽多酚的提取

根据Zhang 等[28]方法稍作修改，准确称取2.0 g绿豆芽粉于烧杯中，以1∶30 的料液比加入60 mL 70%的乙醇溶液，混匀后置于超声微波萃取仪中，设置超声时间、超声温度和微波功率，萃取结束后取出置于离心机中，在转速为4 000 r·min-1下离心10 min，收集上清溶液。向沉淀物中再次加入60 mL 60%乙醇水溶液，重复上述步骤，合并两次离心后得到的上清液于旋转蒸发仪中，在45 ℃条件下旋至无水状态，残余物用70%甲醇洗出定容至至10 mL，得待测多酚提取液，分装后冻存于-20 ℃的冰箱中备用。

1.2.3 多酚含量的测定

根据Folin-Ciocalteu[29]法稍作修改，得线性方程为y=0.117 7 x+0.004 8，R2=0.999 8，线性关系良好。多酚含量测定结果以干基1 g 绿豆芽粉样品中所含没食子酸当量（mg gallic acid equivalents/g dry weight）表示，简写为mg GAE/g DW。多酚含量公式如下：

式中：X 为样品中多酚含量（mg GAE/g DW）；ρ为根据标准曲线方程得出的待测液中多酚的质量浓度（mg·mL-1）V 为待测液体积/mL；N 为稀释倍数；m为样品质量/g。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 料液比对多酚含量的影响

选择超声温度为30 ℃，微波功率为400 W，超声时间为1 200 s，考察料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 时对多酚含量的影响。

1.2.4.2 超声时间对多酚含量的影响

选择超声温度为30 ℃，微波功率为400 W，料液比为1∶25，考察超声时间为800，1 000，1 200，1 400，1 600 s 时对多酚含量的影响。

1.2.4.3 超声温度对多酚含量的影响

选择超声时间为1 200 s，微波功率为400 W，料液比为1∶25，考察超声温度为25，30，35，40，45 ℃时对多酚含量的影响。

1.2.4.4 微波功率对多酚含量的影响

选择超声温度为30 ℃，超声时间为1 200 s，料液比为1∶25，考察微波功率为300、400、500、600、700 W 时对多酚含量的影响。

1.2.5 响应面优化试验

以单因素试验为基础，采用Design- Expert8.0.6软件进行Box-Benhnken 优化实验设计，自变量的四个因素分别为料液比、超声时间、超声温度、微波功率，响应值为多酚含量，设计四因素三水平响应面优化实验，如表1 所示。

表1 响应面因素水平设计Table 1 Level design of response surface factors

1.2.6 体外抗氧化能力的测定

1.2.6.1 DPPH 清除能力的测定

用无水乙醇配制0.2 mmol·L-1的DPPH 溶液，0～4 ℃冰箱中避光保存。将绿豆芽多酚提取液稀释成分别稀释成浓度梯度为2%、4%、6%、8%、10%，取2 mL于试管中，加入2 mL DPPH 溶液，混匀后避光反应30 min，517 nm 处测定吸光度，重复3 次。用Vc 作阳性对照，DPPH 清除率计算公式如下：

其中：A0为空白对照液的吸光度值；A1为样品测定的吸光度值；A2为无水乙醇对照组的吸光度值。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除能力的测定

配制ABTS 自由基储备液：称取0.1 g ABTS 和0.029 g 过硫酸钾粉末，用蒸馏水定容至100 mL，置于4 ℃冰箱中备用，使用前稀释至734 nm 处吸光度为0.700±0.020。将绿豆芽多酚提取液稀释成浓度梯度为10%、20%、30%、40%、50%，取0.2 mL 于试管中，加入5.8 mL ABTS 溶液，混匀后避光反应6 min，734 nm 处测定吸光度，重复3 次。用Vc 作阳性对照，ABTS 自由基清除率计算公式如下：

其中：Ai为空白对照液的吸光度值；Aj为样品测定的吸光度值；Aw为对照组的吸光度值。

1.3 数据处理

利用Excel 2011、Design Expert 8.0.6、SPSS 13.0软件进行绘图、数据处理和显著性分析，P＜0.05 表示显著，P＜0.01 表示极显著。每次试验均重复三次。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 料液比对绿豆芽多酚含量的影响

不同料液比对绿豆芽多酚含量的影响如图1 所示。

图1 料液比对多酚含量的影响Fig.1 Effect of material-liquid ratio on polyphenol content

由图1 可以看出，随着料液比的增加，多酚含量整体呈现上升趋势，料液比在1∶15 至1∶25 时增长趋势较明显，而在1∶25 至1∶35 时增长缓慢，含量变化不再显著，在料液比为1∶35 时多酚含量达到最高，为23.195 mg GAE/g DW，与1∶25 时的多酚含量相差甚微。因此，选择料液比1∶20、1∶25、1∶30 作为料液比这一因素的3 个水平，进行响应面优化试验设计。

2.1.2 超声时间对绿豆芽多酚含量的影响

不同料超声时间对绿豆芽多酚含量的影响如图2 所示。

图2 超声时间对多酚含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on polyphenol extraction

由图2 可以看出，多酚含量随着超声时间的增加呈现出先上升后下降的趋势，在1 000 s 时多酚含量达到最高，为23.158 mg GAE/g DW。且在1 200 s以后，多酚提取含量已经明显低于提取时间800 s 时的提取含量。经分析可以推测，这个结果可能是由于绿豆芽粉中的多酚与蛋白质、纤维素等物质有较强结合作用，所以当超声时间在一定范围以内时，多酚溶出率逐渐升高；而当其溶出率达到顶点后再继续萃取，由于较强的超声-微波作用力，多酚类物质降解的可能性增大，从而影响了多酚的提取效率，导致多酚提取含量降低[30]。因此，选择时间为800、1 000、1 200 s 做超声时间这一因素的3 个水平，进行响应面优化试验设计。

2.1.3 超声温度对绿豆芽多酚含量的影响

不同超声温度绿豆芽多酚含量的影响如图3 所示。

由图3 可以看出，当多酚的超声温度升高时，多酚提含量呈现先上升后下降的趋势，在35～45 ℃区间，多酚含量几乎无太大变化，在30 ℃时多酚含量达到最高，为22.871 mg GAE/g DW。因此选择温度为25、30、35 ℃作为超声温度这一因素的3 个水平，进行响应面优化试验设计。

图3 超声温度对多酚含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol extraction

2.1.4 微波功率对绿豆芽多酚含量的影响

不同料微波功率对绿豆芽多酚含量的影响如图4 所示。

图4 微波功率对多酚含量的影响Fig.4 Effect of microwave power on polyphenol extraction

由图4 可以看出，当微波功率升高时，多酚含量同样呈现先上升后下降的趋势，在微波功率为400 W时，多酚含量达到最高，为23.352 mg GAE/g DW。当微波功率达到500 W 时，多酚含量急剧下降，这可能是由于功率过高反而破坏了多酚的分子结构，从而致使多酚溶出量减少，多酚提取率下降[18]。因此选择功率为300、400、500 W 作为微波功率这一因素的3个水平，进行响应面优化试验设计。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 Box-Behnken 试验设计

根据表1 的因素水平分析及单因素试验结果，设计4 因素3 水平Box-Behnken 中心组合试验，设 计绿豆芽多酚优化提取方案与结果如表2 所示。

表2 响应面设计方案与结果Table 2 Response surface design scheme and results

该响应面共设29 个试验点，2、3、12、16、15 五个中心实验点，重复5 次试验评估试验误差，由表2 可知中心试验点的平均值为23.42±0.59 mg GAE/g DW，误差极小，符合响应面试验设计要求。根据优化试验的结果进行多元回归拟合，得到回归方程为：

Y =23.42 +0.60·A +0.66·B +0.028·C +1.62·D +0.35·AB+0.23·AC-0.098·AD+0.013·0.075BD+0.32·CD-2.40·A2-2.26·C2-2.96·D2

式中：Y 为多酚含量；A、B、C、D 分别代表超声时间、微波功率、超声温度、料液比的水平数。

2.2.2 模型显著性检验

对绿豆芽多酚优化提取试验的线性回归方程进行方差分析，结果如表3 所示。

由表3 可知，模型参数中，A、B 的P＜0.01，表明超声时间对多酚的影响特别显著，A2、B2、C2、D2的P＜0.000 1，表明超声时间的二次项、微波功率的二次项、超声温度的二次项及料液比的二次项对多酚的影响均极其显著；总模型方程也极其显著（P＜0.000 1）；R2=95.69，表明模型相关度较好，仅有4.31 的变异模型；变异系数C·V=3.40，即试验重复性较好且模型可信度较高；失拟项的P 值为0.399 5（P＞0.05），这也表明了模型与试验结果的拟合度较高，即该模型的预测值与实际值误差较小。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

为了能够更加直观清晰地反映出四个因素对响应值的影响，利用Design Expert 8.0.6 软件绘制三维模型图，结果如图5 所示。

图5 不同提取因素对多酚提取率的交互作用Fig.5 Interaction of different extraction factors on extraction rate of polyphenols

由于可根据等高线的形状推测出两因素间交互作用的强弱，若两个因素的等高线呈椭圆状则说明两者交互显著，如若两个因素的等高线呈现圆状则交互不显著[31]。由图5 可知，微波功率与超声温度交互作用较弱（图5b），超声时间与超声温度交互作用较弱（图5c），微波功率与超声时间交互作用也呈现交互较弱的形态（图5f），而料液比与时间、功率、温度的交互作用均相对显著（图5a，图5d，图5e），这与表3 得到的结果相一致；并且由图5 可以清晰地看出，在各个因素下的多酚提取率均呈现出先上升后下降的形态，因此可以分析得出该响应面的极值点即为其响应面的最高点[32]，此时多酚的提取率最佳，对二次回归线性拟合方程求一阶偏导数等于零。得到的料液比为1∶26.38，超声时间为1 028 s，超声温度为35.16 ℃，微波功率为422 W，多酚提取含量预测值为23.76 mg GAE/g DW。为试验操作方便，可将工艺参数优化更正为料液比1∶26，超声时间为1 028 s，超声温度为35 ℃，微波功率为422 W，这与蓝蔚青[33]、钱敏[34]等分析的结果相似。

将响应面优化后得到的最佳工艺参数进行试验验证，按同样的提取方法利用优化后的工艺参数提取发芽4~5 cm 绿豆芽中的多酚，得到的多酚含量为24.12 mg GAE/g DW，该值与预测值23.76 mg GAE/g DW相接近。因此该响应面回归模型具有可靠性。

2.3 抗氧化能力测定的结果

2.3.1 绿豆芽多酚的DPPH 清除能力

由图6 可以看出，随着绿豆芽多酚提取液与Vc浓度的增加，对DPPH 的清除能力也呈现上升的趋势，在浓度区间为0~2%时，清除能力上升显著；而当发芽绿豆多酚浓度达到10%时，DPPH 清除率几乎接近Vc 水平，此时清除率可达94.57%。

图6 绿豆芽多酚的DPPH 清除能力Fig.6 DPPH scavenging ability of mung bean sprouts polyphenols

2.3.2 绿豆芽多酚对ABTS·+的清除能力

图7 绿豆芽多酚的ABTS·+清除能力Fig.7 ABTS·+ scavenging ability of mung bean sprouts

由图7 可以看出，在浓度0~0.1 之间，绿豆芽多酚提取液对ABTS·+的清除能力与Vc 对ABTS·+的清除能力相当；在样本浓度达到50%时，绿豆芽多酚的ABTS·+清除能力又一次接近Vc 清除水平，此时清除率为94.54%。

3 结论

采用超声微波辅助提取绿豆芽多酚，利用响应面法分析研究各工艺参数对绿豆芽多酚含量的影响及各因素之前存在的相关性。结果发现，在料液比1∶26、超声时间1 028 s、超声温度35 ℃、微波功率422 W时，优化后预测绿豆芽多酚提取含量为23.76 mg GAE/g DW，实测值为24.12 mg GAE/g DW，该响应面回归模型具有可靠性。对绿豆芽多酚提取液的抗氧化能力进行测定分析，结果表明，在绿豆芽多酚提取液浓度为10%时，对DPPH 的清除率达到94.57%，接近该浓度下Vc 的清除能力；在绿豆芽多酚提取液浓度为50%时，对ABTS·+清除率达到94.54%，接近该浓度下Vc 的清除能力。结果可为以后绿豆芽多酚活性物质的应用提供理论参考。