间充质干细胞治疗下肢静脉性溃疡的应用和机制

徐明媛，温见燕，刘 鹏*

（1．北京大学医学部中日友好临床医学院，北京 100029；2．中日友好医院 心脏血管外科，北京 100029）

下肢静脉性溃疡（venous leg ulcers，VLU）常由慢性静脉疾病（chronic venous disease，CVD）引起，是下肢慢性静脉功能不全（chronic venous insufficiency，CVI）严重和难治的表现。2014年，血管外科协会和美国静脉论坛发布了相关临床实践指南，将VLU 定义为发生在静脉高压影响区域的腿部或足部开放性皮肤病变[1]。其表现通常为位于足靴区的单发或多发的浅表溃疡，边缘形状不规则，渗出液为黄白色，可见纤维及肉芽组织，坏死组织很少，伴有不同程度的疼痛、下肢浮肿、湿疹及瘙痒[2]。VLU 约占所有下肢溃疡的70%，每年新发病率约为1.5%，是最常见的下肢溃疡类型[3]。研究报告显示，静脉溃疡平均需要6～12 个月的时间才能完全治愈，其中70%可能在闭合5年内复发。近年研究人员对间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs） 治疗皮肤损伤进行了广泛的研究并观察到有益的效果。但这些研究主要集中于缺血性伤口、糖尿病伤口和辐照伤口，现就MSCs 治疗VLU 其临床应用和机制做一综述。

1 VLU 的病理过程概述

VLU 其发病的中心环节是静脉高压的形成。CVD 导致局部静脉曲张，中膜结构受到严重破坏，平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）失去收缩功能，并向分泌表型转变，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中胶原蛋白水平增加，弹性蛋白水平降低，降低了静脉收缩功能；内皮的损伤和瓣膜破坏进一步抑制了静脉正常收缩的能力。静脉收缩不良会导致静脉纤维化，加之小腿肌肉泵功能不足最终形成静脉高压[4]，影响浅静脉、深静脉和介于两者之间的穿支静脉系统。

正常伤口愈合分为止血、炎症、增殖、重塑4 个连续阶段。VLU 的特征性阶段为炎症持续状态，涉及白细胞（特别是巨噬细胞）以及多种趋化因子、细胞因子、生长因子、金属蛋白酶的活化和表达。在微循环中，血管内皮细胞功能障碍，表面糖萼受到剪切应力损伤，激活趋化因子（MCP-1和MIP-1）、黏附分子（ICAM-1、VCAM-1 和选择素）、内皮调节因子（NO）等，可诱导白细胞迁移[5]；静脉高压导致毛细血管床扩张，内皮窗孔扩大，纤维蛋白原和红细胞外溢，由于血液和组织液中的纤维蛋白溶解活性不足，纤维蛋白原形成大分子纤维蛋白沉积在毛细血管周围，阻碍氧气和其他营养物质通过；同时红细胞被降解，铁离子冗余沉积在真皮间质中，红细胞降解产物、血红蛋白中的铁与间质中的蛋白共同作为炎症介质传导慢性炎症信号，吸引巨噬细胞和肥大细胞游走出血管；这些过程促进炎症级联反应，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等细胞因子产生增多，以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达增加。毛细血管、毛细血管后小静脉、间质和淋巴管等微循环结构可对过度反应的炎症途径和细胞因子、趋化因子、MMPs、铁自由基等物质作出反应[2]，导致皮肤和真皮损害。

2 VLU 的压力治疗和外科治疗

VLU 的治疗主要针对慢性溃疡和慢性静脉功能不全2 方面。对不伴发动脉疾病的静脉性溃疡患者，压力治疗是初始和长期治疗的标准治疗方式。给予溃疡的静脉外部压力可以使液体从组织间隙进入血管和淋巴腔，并增强小腿肌肉泵的活动能力，能够减轻局部水肿和疼痛、改善静脉回流、促进愈合和防止复发[6]。用于压力治疗的装置分为静态压缩、动态压缩和混合压缩，压力范围分为轻度（＜20mmHg）、中度（20～40mmHg）、强（40～60mmHg）、极强（＞60mmHg）[7]，压力治疗6 个月后约有30%～75%的VLU 会愈合[1，3]。但压力治疗易致患者依从性不佳，使用不合规及随访频率低，限制临床医生对症状恶化患者进行干预。对于患有静脉功能不全但不伴深静脉阻塞的患者，可选用外科治疗手段，包括开放式手术、腔内治疗及微创手术等，浅静脉反流可选择高位结扎、剥脱或射频消融[8]；若伴有穿支反流，则需要结扎功能不全的穿通静脉。尽管进行了适当的治疗，VLU 仍有漫长的愈合过程，并可多次复发，对于复发性溃疡的处理需开发新的治疗方式。

3 细胞疗法——MSCs 的治疗潜力及应用

MSCs 作为一种具备自我更新和多向分化能力的特殊细胞，其来源丰富，免疫原性低，能够分化为多个谱系细胞，有潜力应用于皮肤缺损的治疗[9]。国际间充质干细胞与组织干细胞委员会提出了用于实验室科学研究的MSCs最低标准：（1） 在标准培养条件下时，MSCs 能贴壁生长；（2）MSCs 必须表达基质细胞相关抗原CD105、CD73 和CD90，并且不表达淋巴造血细胞相关抗原CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α 或CD19 和HLA-DR；3）MSCs 在 体外条件下可以诱导分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞。目前多项研究已证实MSCs 的应用是治疗VLU 较为理想的方案。

3.1 MSCs 在VLU 中的应用

3.1.1 骨髓来源的细胞（bone marrow-derived cells，BMDCs）在VLU 中的应用

骨髓是MSCs 的主要来源之一，在VLU 的治疗中有一定的应用。直接将骨髓抽吸物涂抹在溃疡表面及注入其周围，可观察到真皮重建及溃疡完全闭合；从骨髓抽吸物中分离出MSCs，在体外扩增后将其以纤维蛋白喷雾的形式表达在溃疡周围，也可加速皮肤愈合；将骨髓浸润的胶原蛋白基质覆盖于溃疡表面，可诱导出新鲜健康的肉芽组织；以上均表明BMDCs 在促进溃疡愈合中的有益作用。将处理过的自体BMDCs 多次注射到难治性溃疡周围中，可以观察到溃疡面积缩小和疼痛感降低，表明自体BMDCs疗法安全可行有效[10]。

3.1.2 脂肪来源的基质细胞 （adipose-derived stromal cells，ADSCs）在VLU 中的应用

脂肪组织和骨髓组织一样，均来自于中胚层，含有大量的细胞基质成分。1964年Rodbell 采用蛋白酶消化和梯度离心的方法，由脂肪组织中分离得到富含细胞成分，并将其命名为基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF）。2001年，Zuk 等通过系列研究证实，SVF 中的细胞成分具有多细胞系分化能力。ADSCs 也是多能干细胞，具有与骨髓间充质干细胞相似的特性，它们能表达相同的表面标志物，具有相似的基因表达谱和相似的分化潜能。ADSCs 在脂肪组织中大量存在，且易于分离和扩增，可以替代骨髓来源的干细胞。

Maslowski 等[11]将富含ADSCs 的细胞浓缩物皮下植入到伤口及伤口周围，进而评估自体ADSCs 移植治疗慢性静脉淤积性溃疡的安全性和潜在疗效。他们观察到75%的溃疡有所改善，伤口大小与伤口愈合程度之间呈高度负相关性，且溃疡愈合与评估的其它参数没有相关性，治疗过程中也没有观察到严重的副作用，表明ADSCs 的自体移植可能是一种安全且有希望的治疗慢性静脉溃疡的方法。Zollino 等[12]的研究表明，SVF 中CD34+/CD45-非造血细胞的百分比与愈合时间呈负相关，可能是治疗的预测指标。Kavala 等人[13]的研究纳入了31 例接受了外科手术而6 个月后未显示溃疡治疗获益的患者，将自体SVF 注入到溃疡及其周围，并加用弹性绷带治疗，能够降低一年复发率。Larsen 等[14]将富含自体ADSCs 的高密度脂肪抽吸物置于OASIS 伤口基质敷料上，每日局部滴入噻吗洛尔，联合压力治疗，使30年VLU 患者的溃疡完全上皮化，并持续愈合了15 个月以上；进一步研究证明，噻吗洛尔能降低局部微生物感染诱导ADSCs 产生IL-6、IL-8 的水平。也有个例研究证明MSCs 移植产生的免疫排斥反应较小。

3.1.3 胎盘MSCs 在VLU 中的应用

一项前瞻性的单臂研究比较了局部应用冷冻保存的人胎盘组织联合标准治疗与单纯标准治疗的差异[15]，结果显示联合治疗能够使53%的标准治疗无效的VLU 实现溃疡完全愈合，80%的VLU 溃疡面积减少一半，这表明胎盘来源的MSCs 可辅助治疗慢性难治性VLU。

3.2 MSCs 的作用机制

在慢性伤口环境中，MSCs 能通过多种机制减轻炎症持续反应： 减少促炎细胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的分泌，同时增加抗炎细胞因子IL-10 的释放[16]，具有显著的抗炎能力；诱导巨噬细胞从有极强促炎活性的M1 型转变为M2 型[17]，后者能促进伤口愈合和ECM 沉积，减轻铁过载引起的组织破坏；分泌抗炎蛋白TSG-6[18]及激活巨噬细胞产生IL-10[19]等机制来抑制炎症反应，增强机体的免疫调节作用。MSCs 还能通过旁分泌机制产生许多组织修复介质[20]，包括碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）、TGF-β、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，诱导细胞迁移和增殖，促进血管新生，重建正常的血液供应，为表皮和真皮细胞的迁移和增殖提供了有利的微环境。MSCs 还可通过分泌金属蛋白酶组织抑制剂 （tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP），抑制MMP-2 和MMP-9，保护ECM 和内皮细胞免受破坏。除了分泌可溶性分子外，MSCs 也能释放外泌体，参与细胞内通讯[21]，促进表皮细胞的迁移和生长、抑制免疫、促进血管新生、抑制瘢痕形成[22，23]。

3.3 总结

细胞疗法在VLU 中的应用目前仅限于对标准治疗无反应的患者，可被视为压力治疗和外科治疗的补充。MSCs来源广泛、易于获取、同种移植免疫排斥很小，相比于其他干细胞，更具有治疗潜力。对骨髓而言，随着年龄的增长，MSCs 的数量和分化潜能下降，且获取骨髓是有创性操作，会给供者带来一定的伤害，获取的骨髓中含有许多造血组织，分离纯化困难，造成材料浪费；人类胎盘组织MSCs 制成生物产品价格昂贵，没有成本-效益分析，可能存在伦理问题，研究和应用尚存在困难；而脂肪来源的MSCs 原料更加广泛，可多次自体取材，并发症少，培养成功率高，集落数量最多，基于其综合优势，脂肪来源的MSCs 可作为治疗VLU 最佳细胞来源。脐带血MSCs 增殖能力最强、免疫原性低、获取容易[24]，在皮肤缺陷小鼠模型中减少成纤维细胞的积聚，减轻疤痕形成，但目前尚无治疗VLU 的临床应用证据。MSCs 应用途径有很多，包括注射、涂抹、喷雾等方式，尽管研究结果提示上述途径均能够发挥治疗作用，但因其最终存活的MSCs 数量有限，因此疗效并不十分理想。相比之下，干细胞条件培养基能收集MSCs 分泌的大量细胞因子，生物工程支架能补充损伤修所需的基质和营养成分，联合使用富血小板血浆[25]、含MMPs 抑制剂的伤口敷料[26]等这些应用途径能最大限度的发挥MSCs 的治疗作用。另外MSCs 的生物学特性具有可塑性，通过对MSCs 进行低氧预处理、生物活性分子预处理、基因修饰预处理和力学刺激预处理等[27]，使其生物效能增强，功能达到最大化。

4 展望

VLU 的病理生理机制复杂，愈合周期长，复发率高。MSCs 作为一种具备自我更新和多向分化能力的特殊细胞，多项研究均证实其在伤口修复和组织再生中的重要作用，有潜力应用于治疗VLU。MSCs 易于获取，并发症少，在VLU 患者中应用均表现出较好的治疗效果。但要将其广泛地用于VLU 的治疗仍有几个关键问题需要解决： ①MSCs治疗VLU 的分子机制仍不十分明确，需要进一步探究；②需要进一步研究以确定最佳的MSCs 细胞来源和细胞治疗方式；③MSCs 治疗下肢静脉溃疡的周期和不良反应仍不明确，仍需更多动物实验以及大样本人体实验来验证；④加用细胞治疗的时期仍需进一步实验确定。