细胞外囊泡(EVs)在ARDS中作用机制的研究进展

张红伟，王 帅，张春媚，赵忠岩

(吉林大学中日联谊医院 重症医学科，吉林 长春130033)

ARDS(急性呼吸窘迫综合征)是以肺顺应性降低、呼吸衰竭、顽固性低氧血症为特点的一类异质性疾病的统称，在重症监护室总发病率占10%，病死率高达35%-40%，弥漫性肺泡损伤是其病理特征性改变，表现为肺泡Ⅰ型上皮细胞破坏，Ⅱ型上皮细胞增殖、内皮细胞坏死，而后进展为肺泡结构功能改变，不可逆性肺纤维化。在炎症反应中，近些年研究发现致病微生物和免疫细胞分泌的细胞外囊泡在引发和调节ARDS病理反应中具有重要作用。

1 细胞外囊泡分类和功能

细胞外囊泡样分子最初是由Chargaff和West于1946年首次介绍出来，EVs在正常血浆中被认为是促凝血功能的血小板衍生颗粒[1]，1983年Philip Stahl和Clifford Harding通过脉冲追逐(pulse-chase)和电子显微镜发现多泡体与细胞膜融合释放出小的膜泡,而后Johnston将这种囊泡定义为外泌体[2]。随后的众多研究者发现所有细胞都可以释放EVs，由于研究方法、实验标准、生物标本来源等不统一，研究者在对各囊泡的命名上也不一致，例如文中提到的微粒(microparticle)后来认为是属于微泡范畴，ISEV先后在2014年和2018年发表关于EVs的最低标准要求，将该类囊泡样物质用EVs概念进行统称。EVs大致可分为3类：外泌体(exosomes)40-200 nm、微泡(microvesicles)200-2 000 nm和凋亡小体(apoptotic bodies)500-2 000 nm；外泌体是内吞体向内凹陷形成多泡体(MVB)，后多泡体与细胞膜融合释放出外泌体；微泡起源于细胞膜，是通过细胞膜向外出芽生成；凋亡小体是在细胞凋亡过程中发生细胞膜破裂时释放。已证实的ESCRT(内吞体分选转运复合体)系统在多泡体的形成以及释放外泌体中起着重要作用[3]。EVs与其母细胞具有相同表面标记蛋白，比如肺泡上皮细胞所衍生出的EVs具有表面活性蛋白(caveolin-1)，外泌体中富含上皮黏蛋白，黑色素瘤细胞微泡富含囊泡相关膜蛋白3(VAMP3)，外泌体富含转铁蛋白受体，但这种转铁蛋白受体在微泡中几乎不存在[4]。但是目前来说不存在能识别EVs的唯一特定标记物，CD9、CD63、CD81和CD82等均可在外泌体和微泡中表达。

不同于细胞间直接接触与细胞分泌的信号分子传递信息，EVs是细胞间通讯的第3种方式，是作为功能性细胞膜和胞质蛋白、脂质和核酸的细胞间转移载体，它们可以通过囊泡表面膜蛋白与受体膜蛋白直接作用或者和受体细胞粘附融合后释放内部包裹的核酸、蛋白质或脂类物质等调控受体细胞的细胞功能[5]。在ARDS动物模型中发现EVs在肺内免疫应答和炎症信号转导中处于重要地位[6]。EVs中的RNA主要包含了tRNA、rRNA、mRNA、miRNA、长链RNA等，这些均含有大量的3′UTR mRNA片段，并且有多个microRNA(miRNA)结合位点，提示EVs作为miRNA循环的载体调节受体细胞的基因转录和表达，这也是miRNA的研究在EVs中成为重点的原因[7]；相比对于RNA的大量研究，DNA成分在EVs中研究较少，最近有研究者对EVs中的dsDNA和组蛋白存在提出质疑[8]；EVs中的脂类物质主要包含磷脂酰丝氨酸、胆固醇、脂肪酸、神经鞘磷脂、神经酰胺等，是组成囊泡双层脂质膜的成分，不同类型的EVs其脂质结构也不相同。EVs中的蛋白质成分包括了表面抗原(MHCI、MHCII)、粘附因子(比如整合素、乳凝集素、ICAM)、多种趋化因子和炎性细胞因子等(如IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-18、IL-32、TNF、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL20)，这些蛋白质在细胞的免疫调节中有着重要作用。除此之外，针对EVs对蛋白质和基因在细胞外环境中可以起到保护作用的特点，有研究认为可将其作为一种潜在生物标记物的来源，以及作为靶向药或基因的载体，在治疗上可能具有广阔前景[4]。

2 病原微生物分泌的EVs在ARDS中的作用

微生物感染和ARDS密切相关，细菌EVs是在上世纪60年代的关于大肠杆菌的报道中首次提出的，1990年以后至今对细菌EVs的研究不断增加，主要以研究革兰阴性菌占多数，其产生EVs的途径主要是通过挤压的方式(pinching off)出膜，因为相比较革兰阴性菌，革兰阳性菌的细胞膜外有一层厚的肽聚糖细胞壁，囊泡如何出膜机制尚不清楚(真菌和分枝杆菌同样也不清楚)，通常将革兰阴性菌的EVs称OMVs(Outer Membrane Vesicles)，可以携带毒力因子、DNA、RNA、免疫调节因子等。细菌EVs与宿主细胞作用有以下3种途径：直接激活宿主受体、传递细菌EVs内容物和完全融入宿主细胞细胞质内。OMVs通过病原体相关分子模式(PAMPs)诱导炎症免疫应答，PAMPs中的LPS、肽聚糖、鞭毛蛋白、孔蛋白以及脂蛋白与宿主细胞的TLR作用后，通过MAPK信号转导促进炎性因子分泌[9]。最近的研究也证实了细菌的EVs具有可以将其内容物转移至宿主从而调节宿主先天免疫的能力。An等人发现金黄色葡萄球菌EVs中包含的α-溶血素是导致肺炎的重要毒力因子，而磷霉素可以通过降低MAPK(主要是ERK和p38途径)磷酸化和抑制NLRP3炎症相关蛋白表达来减轻肺部感染[10]。Schlatter等人报道金黄色葡萄球菌在PSM(酚溶性调节蛋白)作用下通过增加膜流动性促进金葡菌膜释放含有LPS的EVs，囊泡破裂后LPS会激活TLR2介导的炎症途径[11]。有研究者在铜绿假单胞菌的研究中证实其分泌的OMVs内所含有的sRNA可抑制人上皮细胞炎性因子IL-8表达和减弱小鼠肺内KC细胞因子分泌和中性粒细胞募集[12]。有研究者报道了肺炎链球菌EVs的免疫调节能力，EVs通过被血清蛋白识别，结合补体系统C3b启动补体替代途径，形成补体复合物C5b-9，在人血清中加入肺炎链球菌EVs后导致巨噬细胞的吞噬活性减弱[13]。

3 免疫细胞分泌的EVs在ARDS中的作用

ARDS的发病机制中，免疫细胞是其中必不可少的环节，参与炎症介质的表达和调节，肺内固有免疫细胞包括了肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板等，他们之间可以通过各自分泌的EVs在ARDS中传递炎症信号。

3.1 免疫细胞EVs参与模式识别受体(PRRs)相关信号通路

PRRs是人体固有免疫系统中的重要环节，是抵御病原微生物入侵的第一道防线，固有免疫细胞上的PRRs通过识别PAMP(病原相关分子模式)和DAMPs(损伤相关分子模式)等危险信号来调节免疫应答和炎症反应，PRRs分4种不同类型：TLRs、CLRs(C型凝集素受体)、RLRs(甲酸诱导基因(RIG)-Ⅰ型受体)和NLRs[14]。关于ARDS的EVs研究主要涉及TLRs和NLRs两种信号转导通路。TLRs的特点是N端富含亮氨酸重复序列(LRRs)，细胞质内含有Toll/IL-1R同源区(TIR)，Toll样受体在大部分免疫细胞中都有表达，能够识别外源性配体(如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等)和内源性配体(宿主细胞在组织损伤或者应激下释放的多种蛋白如融合蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、热休克蛋白以及透明质酸等)，TLR4主要识别LPS或内毒素，TLR2主要识别LTA、PGN，在与配体识别后构象改变，将信号传递至下游。NLRs有NACHT和LRR两个结构域，当PAMP与LRR结合后，NLR构象改变，暴露出NACHT结构域，NLR分子N端的效应结构域与激酶或caspase结合后开始活化。

3.1.1免疫细胞EVs激活Toll样受体信号通路 Lee[6]将ARDS小鼠分为非感染组(高氧和盐酸)和感染组(LPS和肺炎球菌)，处死后提取BALF中的EVs发现感染组EVs主要来源于肺泡巨噬细胞,非感染组EVs来源于肺上皮细胞，为研究EVs的功能，分别将提取出的EVs注射进健康小鼠气管内，发现感染组肺泡巨噬细胞的TLR6、TLR9、CD80、IL-1β和IL-10基因表达上调，非感染组EVs刺激巨噬细胞TLR2、IL-6、TNF-α表达增加，而且除肺炎链球菌外，高氧、盐酸、LPS、肺炎假单胞菌刺激产生的EVs都上调了巨噬细胞MyD88基因的表达，并且TLR2和TLR6都是NF-κB的重要受体，表明EVs可以通过TLRs-MyD88-NF-κB信号转导途径刺激巨噬细胞在肺内的炎症反应。

LPS与单核/巨噬细胞上的TLR4结合，可以释放大量的TNF-α和IL-1β，但在同等条件下，人肺微血管内皮细胞却基本不释放TNF-α和IL-1β，主要是以IL-6、IL-8、ICAM-1和选择素E等中性粒细胞趋化因子为主[15]。有人[16]同时用肺内皮细胞EVs和LPS处理小鼠模型，导致肺和全身IL-1β和TNF-α水平升高，中性粒细胞的募集和组织MPO水平的提高。用TNF-α体外刺激人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)和小鼠内皮细胞(MLEC)后释放出的EVs会激活NF-κB和PPAR介导的ICAM-1途径，促进炎症信号转导[17-18]。与之相似的是Soni[19]在用LPS诱导的ARDS小鼠BALF中提取巨噬细胞EVs，将巨噬细胞EVs在体外与小鼠上皮细胞培养4 h后,检测到上皮细胞分泌的ICAM-1和KC(也叫CXCL-1)含量增加，在培养液中加入TNF抗体后ICAM-1表达受抑制，说明肺泡巨噬细胞EVs中的肿瘤坏死因子参与介导了肺上皮细胞炎症的表达。研究者发现人血小板可以通过激活内皮细胞直接参与内毒素所引起的炎症反应，血小板分泌的EVs中含有成熟的IL-1β，依赖TLR4途径诱导内皮细胞VCAM-1的表达增加[20]。

3.1.2免疫细胞EVs激活NLRP3炎症小体 NLRP3炎症小体是一种蛋白复合物，由NLRP3受体、衔接蛋白ASC和pro-caspase1组成，炎症小体被激活后，ASC构象改变，激活pro-caspase1，活性caspase-1释放白介素1家族蛋白，诱导巨噬细胞分泌IL-1β。在炎症反应中，巨噬细胞上的TLR4识别病原体后，产生IL-1β前体，同时巨噬细胞识别损伤细胞释放的ATP，通过NLRP3炎性小体激活caspase-1，使IL-1β前体转变为IL-1β参与炎症反应[21]。EVs可以调节NLRP3炎症小体，参与ARDS的炎症反应过程。Zhang在LPS气道滴注后的ARDS小鼠BALF中发现升高的EVs主要来源于巨噬细胞，同时在体内和体外实验中EVs含有的miR-223/142均大量增加，在抑制炎症方面miR-223和miR-142分别通过抑制NLRP3和ASC，协同抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体活化[22]。

有研究者对LPS诱导的小鼠ARDS模型的BALF进行检测，发现其EVs所含有的miRNA-466家族表达增加。随后他们将含有miRNA-466g和466m-5p基因转染到小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)，一组用LPS和ATP刺激骨髓源性巨噬细胞，另一组在此基础上予以NLRP3抑制剂，证实miRNA-466家族是通过激活NLRP3炎症小体来加重ARDS的肺内炎症[23]。除此之外，Haneklaus等研究者发现miR-223和miR-BART15可以调节EB病毒感染的小鼠NLRP3炎症小体和IL-1β的产生，主要表现为miR-223可以靶向与NLRP3 3’UTR结合，限制单核细胞炎症小体激活，miR-223的过度表达阻止了NLRP3蛋白的积累，并抑制炎症细胞产生IL-1β；其次miR-BART15与NLRP3 3’UTR具有相同靶向位点，通过已感染的B细胞释放包含miR-BART15的外泌体来抑制非感染细胞的NLRP3炎症小体[24]。

3.2 免疫细胞EVs激活JAK-STAT信号通路JAK-STAT信号具有转导多种细胞因子和生长因子的作用，其机制主要为JAKs和STATs的酪氨酸磷酸化，随后以二聚体形式转移到细胞核调节特定DNA序列表达，而大多数STAT相关基因具有促进炎症反应的功能。革兰阴性杆菌产生的LPS通过激活STAT3信号导致急性肺损伤，研究者用小分子STAT3抑制剂LLL12发现在LPS诱导的ARDS小鼠模型中LLL12不但抑制STAT3的激活，同时也抑制多种炎症因子的表达如IL-1β、IL-6、TNF-α等[25]。相反的是SOCS中的蛋白会通过抑制JAK蛋白的磷酸化负调节JAK-STAT信号系统[26]，Bourdonnay报道巨噬细胞在外泌体和微泡中分别分泌SOCS1和SOCS3，经肺泡上皮细胞摄取吸收后抑制STAT活化[27]。

3.3 免疫细胞EVs激活Rho/ROCK信号通路Rho/ROCK信号通路通过Rho与GTP结合激活下游ROCK，使ROCK底物磷酸化，调节内皮及组织细胞通透性、收缩及生长作用。Moon[28]提取高浓度氧诱导的ARDS小鼠BALF后发现，来源于肺泡上皮细胞的EVs中Caspase-3可以激活肺泡巨噬细胞的炎症表达，而EVs中升高的Caspase-8蛋白对IL-6、TNF-α和MIP-2没有显著影响，和Caspase-3也不存在协同作用。为了研究其具体机制，研究者分别加入p38、MAPK、ROCK1和JNK抑制剂，发现只有ROCK1抑制剂可持续抑制肺泡巨噬细胞中IL-6、TNF-α和MIP-2的分泌。从而确定源于肺泡上皮细胞的EVs中caspase-3主要是通过ROCK1途径激活肺泡巨噬细胞。

3.4 免疫细胞EVs参与ARDS凝血改变机制在ARDS和脓毒症等严重肺内感染常伴随体内凝血功能改变及微血栓形成，肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、中性粒细胞及血小板的EVs都不同程度的参与了凝血过程。目前认为含有组织因子的EVs介导凝血改变是通过经典的外源性凝血途径(TF-FVIIa复合物-FXa-FIIa-FIa)和外源性凝血的替代途径(依赖P选择素途径)这两种路径实现的[29]。Falati[30]发现巨噬细胞来源的EVs在血小板P选择蛋白和PSGL-1介导下相互作用激活血小板聚集。P选择蛋白和PSGL-1是血管粘附分子，白细胞释放的EVs中所含有的组织因子和PSGL-1可以在损伤的血管壁上聚集并参与血小板血栓形成[31]。研究者发现源自于肺泡上皮细胞的EVs中包裹的组织因子是ARDS病理过程中促进凝血活性的主要来源，在ARDS中肺泡上皮细胞可通过释放含有组织因子的EVs促进肺内凝血，并由此推测这种改变可能与ARDS中肺泡内纤维蛋白形成以及后续的纤维蛋白沉积有关[32]。动物研究发现血浆中组织因子也来源于血小板释放的EVs，血小板EVs的表面积与血小板相差巨大，但是促凝血活性几乎等同于血小板，主要原因是EVs单位面积上结合的磷脂酰丝氨酸、CD61、CD62P和FX的密度是活化血小板的数倍[33]。

4 总结

EVs 的发现代表了一种新的细胞间通讯模式，在ARDS中参与着炎症信号的转导和调控，本文着重介绍ARDS的炎症反应和信号通路中病原微生物以及先天固有免疫细胞的各EVs所扮演的角色，实际上EVs在ARDS中的作用远不止于此，了解了EVs在ARDS病理过程中的作用，为今后疾病的诊断及治疗中提供理论依据。