内生菌与药用植物活性成分生产的研究进展

刘朝波，钱 刚，李 林

(遵义医科大学 基础医学院细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099)

我国药用植物种类丰富，目前已发现的药用植物约12 000余种，但多数药用植物中的活性成分较低，且受到环境、遗传等多种因素的影响。随着社会经济的发展，对于药用植物的开发与利用进入新的阶段，如何稳定或提高药用成分生产和改变其传统的生产方式成为我国药用植物生产产业中的首要问题。内生菌是药用植物内环境的重要组成部分，一方面分泌植物激素、生长因子等，有利于植物生长发育；另一方面对药用植物活性成分积累和生产具有调控作用，它们通过产生与宿主中活性成分相同或者相似的活性产物的方式增加宿主活性成分，或以植物原有的活性成分转化为新的化合物从而增加活性成分种类[1]。值得注意的是，这些经由内生菌作用的化合物多数具有抗菌、抗肿瘤及抗氧化等作用，是当前药用成分研究与生产的热点[2-4]。因此，对药用植物内生菌的研究也成为我国中药材生产与新药开发方面的重要内容，本文就药用植物内生菌分离、分类概况及其在药用成分开发应用进行阐述。

1 植物内生菌的概念与分类

植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，主要包括内生真菌(Endophytic fungi)、内生细菌(Endophytic bacteria)、内生放线菌(Endophytic actinomyces)[5]。从分布范围和种类上看，内生菌广泛存在于药用植物中，但种属分布与其他植物有差异。如常见植物内生真菌多为黄曲霉菌、担子菌、接合菌、卵菌等，而药用植物内生真菌多为镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、毛壳菌属(Chaetomium)、头孢菌属(Cephalosporin)等，部分具有宿主的专属寄生特异性[6-7]。目前已从药用植物中分离得到的内生细菌超过80属129种，多为假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(EnterobacterHormaecheandEdwards)、土壤杆菌属(AgrobacteriumConn)、芽孢杆菌属(BacillusCohn)。药用植物中的内生放线菌则主要为小双孢菌属(Microbispora)、小单孢菌属(Micromonospora)和链孢囊菌属(Streptosporangtum)，是当前被广泛用于挖掘新生物活性物质的重要内生菌种类。此外，不同于致病菌对宿主植物的破坏，内生真菌、内生细菌和内生放线菌一方面以宿主药用植物的代谢环境作为自身的外环境，吸收营养物质的同时，又得到一定的保护；另一方面它们能合成小分子的物质促进宿主植物的生长和发育，在与其宿主植物经过长期的能量物质交换中逐渐形成了互惠共生的关系，对植物的生命活动也有积极作用[8]。

2 药用植物内生菌分离与鉴定

内生菌的分离是药用植物内生菌研究中的首要步骤，其分离方法主要采用组织块分离法与研磨法。组织块分离方法是将植物的组织块在适宜培养基上进行菌丝培养的方法，通常包括以植物新鲜的根、茎、叶等组织器官作为外植体材料，经过乙醇、次氯酸钠或升汞等进行消毒灭菌，并使用无菌水冲洗后转入PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)、NA培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)、高氏一号培养基等不同的培养基进行培养。对于内生真菌一般采用PDA培养基进行培养、内生细菌采用NA培养基进行培养、内生放线菌采用高氏一号培养基进行培养[9-11]。以分离金钗石斛(Dendrobiumnobile)内生真菌为例，用自来水将金钗石斛的根、茎、叶冲洗干净后晾干，然后进行表面消毒，75 %酒精浸泡30 s，无菌水冲洗5次，随后0.1 %升汞浸泡1 min，无菌水冲洗5次。接下来在无菌环境中将消毒后的叶剪成5 mm×5 mm的方块，根、茎剪成0.5 cm长的片段，然后纵向剪成4个部分，并将切口紧贴于PDA培养基上，每皿放三片，5个重复，25 ℃ 环境培养，待菌丝长出后再进行单菌落划线等进行纯化，所得单菌株斜面保存。从甘草[12](Glycyrrhizauralensis)、艾蒿[13](Artemisiaargyi)、土木香[14](Inulahelenium)等药用植物中采用组织块法已成功分离出多种内生菌。此外，对内生细菌和内生放线菌的分离常采用研磨法，将消毒后的植物组织在无菌环境下切碎，放于无菌研钵中研磨至浆液，稀释10倍，取50微升涂于牛肉膏蛋白胨培养基或者高氏1号培养基上，28 ℃培养。

上述分离纯化后的内生菌通常采用形态学鉴定与分子生物学鉴定2种方法进行鉴定。形态学鉴定是对菌株菌核的特征及结构、孢子着生部位及其形态、大小、排列方式等对菌的种属进行初步鉴定。朱士茂[15]利用形态学方法鉴定从银杏的根、茎、叶中分离得到的16株内生菌，经初步鉴定它们分别属于产孢粘细菌属(Pyxo-spore)、假单胞菌属(Pseudomonas)、革兰氏阳性球菌属(Gram-positivecocci)、芽孢菌属(Bacilluscohn)、土壤杆菌属(Agrobacteriumconn)。内生细菌、放线菌通常采用分子生物学鉴定方法，一般通过16S rDNA测序进行鉴定。首先对纯化后菌株进行PCR扩增16S rDNA并进行测序，将获得序列在NCBI网站进行BLAST比对，即可获知与该序列同源性较高的已知序列，为菌株的分类提供依据。宋颖娟[16]利用组织块法从黄精(Polygonatumsibiricum)和黄芪(Astragaluspropinquus)的块根中分离出17株菌株，通过16S rDNA测序分析，鉴别出黄精内生菌有2株为肠杆菌属(Enterobacterhormaecheandedwards)，4株为芽孢杆菌属(Bacilluscohn)；黄芪内生菌有8株为芽孢杆菌属(Bacilluscohn)，2株为葡萄球菌属(Staphylococcus)，1株为节细菌属(Arthrobacter)。内生真菌分子生物学鉴定一般采用ITS序列分析进行种属鉴定。Chen等[17]通过ITS rDNA 序列和系统发育分析鉴定将锯缘石杉茎、叶和根中分离到52株菌落形态不同的内生真菌分为4类，其中92.31 %为梭状芽孢杆菌属。

尽管利用上述方法已实现对多种药用植物中内生菌的分离与鉴定工作，但近年来多个药用植物内生菌转录组测序工作的研究表明，通过上述方法得到的内生菌种类较少，因此对于内生菌分离方法还有待进一步研究。

3 内生菌参与药用植物重要生命活动过程

已有研究认为，各种环境因子(如温度、光照、微生物等)与药用植物适应不同的生长环境，以及多样化的活性成分的合成相关[18-19]。内生菌作为其中重要的环境因子，对于药用植物的重要生命活动过程均具有密切的关系。如兰科植物的天麻、白及等种子需要在内生菌作用下萌发与生长[20-21]。对石斛、甘蔗及芒萁等的研究表明内生菌不仅有利于植物根系生长，加速对氮、磷、钾元素的吸收，也产生细胞激动素、生长激素(吲哚乙酸、赤霉素)等，促进植物生长，增强植物抗逆能力[22-26]。此外，药用植物内生菌以多种方式参与到其次生代谢产物合成与代谢途径中。

3.1 内生菌促进药用植物的生长发育 内生菌对药用植物的生长发育具有促进作用，并以不同方式促进药用植物的生长。高浓度乙烯会抑制植物生长，有些内生菌因具有ACC(氨基环丙烷羧酸)脱氨酶活性，可以分解乙烯的前体，降低药用植物体内乙烯的含量，从而促进植物的生长[27]。张缇等[28]从绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)中筛选出6株具有ACC脱氨酶活性的细菌，其中1株被验证为木糖葡萄球菌的菌株具有显著的促生作用。铁对植物的生长发育具有很重要的作用，植物缺铁会降低植物的抗性、出现黄叶病[29]。而促生菌分泌的铁载体可以和土壤中Fe3+结合将其还原成Fe2+，使土壤中可溶铁的含量增加，提高植物对土壤中铁的利用率，促进药用植物的生长[30]。宋欢等[31]从雷公藤(Tripterygiumwilfordii)中分离得到NS3与LY1、NS33与LG3混合培养均可提高铁载体的含量，提高雷公藤对铁的利用率，促进其生长。药用植物对氮、磷、钾等元素的吸收能力会影响其的生长能力。张晓冰等[32]发现芽孢杆菌具有固氮、磷酸盐溶解、钾溶解等作用，可以促进植物对氮、磷、钾等元素的吸收。另外，植物激素也是促进植物生长的重要因素，很多内生菌可以产生植物激素，进而促进植物的生长。黄柳彬等[33]从田七中分离出9株内生细菌，其中有7株能产生IAA(吲哚-3-乙酸)，具有促进宿主生长作用。综上，内生菌可通过生物固氮、产生铁载体、溶磷或分泌产生植物生长素等方式促进药用植物的生长发育。

3.2 内生菌参与药用植物抗逆过程 前人研究表明，内生菌能有效的提高药用植物对病原菌的抵抗作用。陈利云等[34]用银杏叶片内生菌乙醇提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ浸泡处理凤尾鸡冠花种子及叶面喷施温室盆栽试验，实验结果表明，内生菌醇提取物Ⅵ提高植物对病原真菌感染的抵抗力。内生菌能有效的促进药用植物抗旱性提高。张霞[35]通过接种内生菌，研究了内生菌对铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)抗逆性的影响，发现接种GDB162和GS222的铁皮石斛苗表现出较高的抗旱性。内生菌与植物共培养能提高植物在高温环境下的生存能力。Redman等[36]发现牛膝草(Hyssopusofficinalis)与弯孢菌共培养后可连续十天在65 ℃ 环境下生存，没有与弯孢菌共培养的牛膝草在50 ℃时则出现干瘪现象。重金属对植物具有毒性作用，把植物与内生菌共培养可以使植物的抗金属能力增强。Govarthanan等[37]从耐盐植物中分离出45株内生菌用于抗金属实验，结果表明大多数菌株具有抗金属能力。因此，具有抗旱、抗高温等抵抗作用的内生菌应用在药用植物培养中，可提高药用植物抗逆、耐害，增强其对环境适应能力。

3.3 内生菌促进药用植物中次生代谢产物合成 内生菌可以利用其代谢产物和药用植物中某些成分以及植物体内的有效成分为前体物质转化为新的化合物，经内生菌代谢产生新的活性成分[38]。彭清忠等[39]分离得到能转化姜黄素的内生真菌Diaporthesp.，其能把姜黄素转化为去甲基姜黄素和二去甲基姜黄素。隆丽林等[40]采用薄层层析法筛选转化虎杖苷的内生真菌，经筛选发现其中l株内生真菌能转化虎杖苷形成新的化合物。然而某些内生菌并不是直接转化产生具有药用成分，而是促进植物次级代谢产物的积累，从而影响植物次生代谢产物产量，对药用植物活性产物的产量有着积极的影响。李艳冰等[41]从滇重楼地下块茎中分离得到23株内生菌，将它们与滇重楼组培苗进行共生培养后，经高效液相色谱法检测组培苗的皂苷含量，筛选出两株能促进滇重楼组培苗皂苷含量的菌株。

内生菌对药用植物次生代谢途径具有调控作用，内生菌在药用植物次生代谢途径中可被作为诱导因子，诱导宿主植物细胞生长和次生代谢产物的合成，提高药用植物的产量及活性成分的含量。戴传超等[42]将从大戟分离得到的镰刀菌的菌丝提取液加入培养了21天的大戟悬浮细胞系中，发现大戟细胞的产量比对照组高34.13 %。陈晓梅等[43]研究中发现在离体培养的条件下，内生真菌和金钗石斛共同培养能够提高多糖的含量，并能影响生物碱的含量。王剑文等[44]发现黄花蒿内生菌细胞壁寡聚糖提取物可以诱导黄花蒿生根细胞中钙离子的增加，从而提高青蒿素的产量。张瑞芬等[45]用内生菌尖孢镰刀菌Dzf17灭活的菌丝和菌液浓缩物诱导盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞，发现采用灭活菌丝诱导后皂苷元产量比对照组提高了2.87倍和2.01倍；采用菌液浓缩物诱导盾叶薯蓣无菌苗和培养细胞后皂苷元产量比对照组提高了1.52倍和1.76倍。柳倩等[46]从香茅草中分离得到芽孢杆菌属的内生菌CcLf-2，再将CcLf-2接种到香茅草无菌苗中，通过实时定量PCR分析表明，CcLf-2的存在可诱导香茅草中柠檬醛生物合成途径相关基因的表达量显著上升。因此，内生菌对药用植物中次生代谢产物合成具有一定积极作用，使用合适的内生菌作用在药用植物上可以提高其次生代谢产物含量，为提高药用植物工业化生产次生代谢产物产量提供新思路。

4 内生菌生产药用活性成分的应用

近年来，众多研究表明药用植物内生菌不仅可以调控植物的次生代谢通路实现对药用活性成分生产的调节，其自身也生产具有药物活性的多种代谢产物，且这些代谢产物大多具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化作用[47-48]。因此，内生菌也成为当前药物生产的新领域。

随着人类体内病原菌的抗药性的不断增强，人们急需找到更多、更好抗菌活性的药物。前人研究表明，内生菌的次生代谢产物具有良好抗菌活性[49-50]。陈淑娟等[51]从红豆杉的树皮中分离得到一株产紫杉醇类化合物的内生真菌，使用不同溶剂对其次级代谢产物进行提取，并将提取物分别作用在大肠杆菌、白色链珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌上，提取得到的次生代谢产物对上述5种致病菌都具有不同程度的抑制作用。迟惠荣等[52]从多花黄精中分离的内生菌中筛选出一株贝莱斯芽胞杆菌，该菌发酵液提的粗取物脂肽会抑制尖孢镰刀菌的生长，抑制率达到51.6 %。

药用植物中部分内生菌的次生代谢产物具有抗肿瘤活性，常见的有喜树碱、长春碱、紫杉醇等。目前，已有研究证实从短叶紫杉、云南红豆杉、银杏等众多药用植物中可以分离得到能产生紫杉醇及其衍生物的内生真菌[53]。长春新碱是治疗白血病和淋巴瘤等症的重要抗癌药物之一，它们通过与未形成纺锤体的微管蛋白结合，导致纺锤体的合成受阻，从而间接达到抗肿瘤的作用[54-55]。张玲琪等[56]从长春花茎的韧皮部分离出一种内生真菌为尖孢镰刀菌，并通过菌株培养与分析，证明了该菌株能产生抗肿瘤药长春新碱成分。喜树碱是从我国特有植物喜树的种子和根皮中提取的一类生物碱，该碱可以抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ，导致DNA断裂，从而使肿瘤细胞死亡[57]。刘吉华等[58]在喜树的根、枝条、叶、果实中分离得到48株内生真菌，经实验证明其中多数能产生喜树碱类似物，都具有不同程度的抗肿瘤效果。除了紫杉醇、长春新碱、喜树碱具有抗肿瘤活性以外，细胞松弛素类、石蒜碱、秋水仙素碱类等内生真菌次代谢产物也具有抗肿瘤活性。

抗氧化活性一直是全球研究的热点，抗氧化物质具有预防衰老等多种药理作用[59]。目前从药用植物内生菌中分离的多种次生代谢产物被证实具有抗氧化活性，受到广泛关注。金卫华等[60]从樱桃皮分离得到7株内生菌，对它们的次生代谢产物进行了抗氧化活性测试，结果表明有6株霉菌菌株均具有抗氧化活性。张新国等[61]从药用植物乌头、唐松草、独活、车前草、薄荷、泽泻中分离得到61株内生菌，并发现大多数内生菌次生代谢物具有抗氧化活性。

综上表明，药用植物中内生菌的多种代谢产物具有其宿主植物的药用活性成分的药理作用或具有不同于宿主的其他药理活性，对于濒危药用植物的保护、新药物合成与开发具有重要的意义。

5 展望

多数药用植物内生菌的次生代谢产物具有药用活性，其在新药开发中具有巨大的开发潜力。如果未来能利用药用植物内生菌生产药物，这将在一定程度上弥补了自然资源的短缺，间接保护部分濒危药用植物，对药用植物内生菌的开发与利用具有现实的理论价值与应用意义。然而，要实现对药用植物内生菌的应用仍存在需要解决的关键问题：1)并不是药用植物中的内生菌都能在人工培养基上面生长。2)使用常规的微生物发酵法和组织培养法培养的植物内生菌次生代谢产物含量低，目前不能够大量地生产。3)筛选效率普遍不高，部分药用植物内生菌未被发现，部分药用植物内生菌的活性代谢产物未被挖掘。随着相关生物技术不断发展、植物内生菌的人工培养基种类增加以及组分不断优化，药用植物内生菌分离效率及其在药用活性成分开发、生产和应用将得到更好发展。