维生素D及其受体在炎症性肠病相关肠纤维化中的作用研究进展

苏丽坦古丽·麦合木提 周辛欣 季峰

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种以缓解与复发交替为特征的，可累及全消化道的慢性非特异性炎症性疾病，主要分为克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）。CD 病变累及肠壁全层，超过三分之一的CD患者会出现肠道狭窄和梗阻，需要手术治疗；UC病变主要局限于黏膜及黏膜下层，过去认为UC是非纤维化疾病，但是近几年的研究发现，3%～11.2%的UC患者会发生纤维化导致的结肠狭窄[1-3]，且在未发生结肠狭窄的UC患者结肠组织中也存在不同程度的纤维化[4]。近年来，尽管在对IBD炎症的理解和抗炎治疗方面取得了巨大的进展，但IBD患者发生肠纤维化的机制以及抗纤维化治疗仍需进一步探索。目前IBD相关肠纤维化导致肠道狭窄患者的治疗方案主要以控制症状为主的外科和内镜治疗，但这些治疗后复发率高[5]，因此需进一步研发相关药物来预防和治疗肠纤维化，以提高IBD患者的生活质量并改善预后。

1 IBD相关肠纤维化的发生机制

IBD相关肠纤维化主要的发生机制为：在炎症因子的长期刺激下，静息的成纤维细胞、血管平滑肌细胞、上皮以及内皮细胞在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）等各类调节因子[6]的作用下转化成肠肌成纤维细胞并增殖活化，大量分泌以I型胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），使 ECM 过度沉积在肠壁，导致肠壁增厚，肠腔狭窄，最终形成肠梗阻[7]。其中TGF-β是存在于多种肠壁细胞中的多功能肽激素，在肠肌成纤维细胞的增殖活化[8]、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[9-10]、ECM 的生成及降解[11-12]等过程中发挥关键性作用。因此，阻断TGF-β信号通路是预防肠纤维化发生、发展的关键环节。此外，近年来研究发现肠道菌群在肠纤维化的发生、发展中发挥了重要作用。在动物模型研究中，将细菌成分肽聚糖多糖直接注射到无菌小鼠肠壁可诱导炎症和纤维化，提示肠道菌群可以促进肠纤维化[13-14]。另一项体外研究表明，侵入肠壁的细菌及其产物可直接与肠肌成纤维细胞表面的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）结合，刺激肠肌成纤维细胞分泌细胞因子和趋化因子，导致肠纤维化的发生[15]。另外，有研究发现细菌鞭毛蛋白可以与肠间质细胞TLR5结合，参与肠道间充质细胞的成纤维反应[16]。

2 维生素D治疗IBD相关肠纤维化的可能机制

1，25二羟基维生素D3是维生素D的主要活性代谢产物，是具有生物活性的脂溶性维生素。在IBD患者中，维生素D除了发挥调节钙和骨稳态的作用之外，还具有抗炎症反应、保护肠道黏膜屏障、维持肠道稳态以及免疫调节等作用[17]。而近期的多项研究表明，维生素D在肝、肾、肺及腹膜等多个组织器官中，通过与维生素D 受体（Vitamin D receptor，VDR）的结合来阻断 TGF-β1/Smad信号转导通路、抑制EMT从而发挥抗纤维化的作用[18-21]。然而，维生素D及VDR在IBD相关肠纤维化中的作用机制尚不清楚，以下就维生素D及VDR在IBD相关肠纤维化的作用及其可能机制的相关研究进行综述，以期为IBD相关肠纤维化的药物治疗提供新的理论依据。

2.1 VDR与TGF-β1/Smad3信号通路 VDR分为细胞膜受体（mVDR）与细胞核受体（nVDR），后者属于甾体类激素核受体超家族成员，广泛分布于人类的小肠及结肠的肠黏膜上皮细胞内[22]。nVDR与1,25（OH）2D3结合后被激活，除了参与机体的钙磷代谢调节之外，还在促进细胞增殖、分化及辅助维生素D发挥其免疫调节作用中起关键作用[23]。临床研究发现，VDR在IBD患者肠黏膜中的表达水平显著低于正常人[24]。另一项研究则发现维生素D可减轻IBD的疾病活动状态，而这一作用依赖于与VDR受体的结合[25]。TGF-β是一种多功能细胞因子，在细胞的分裂、分化、迁移、黏附和死亡等过程中发挥重要作用，不仅影响组织损伤后创面的修复愈合，而且促进纤维化形成。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3种主要亚型，其中TGF-β1是多种纤维化性疾病的重要介质[26-27]。TGF-β1与其受体结合，磷酸化特异性受体并活化下游的Smad（Smad2和Smad3），与中介体Smad（Smad4）形成复合物并进入细胞核内，入核后可作为转录因子与其他DNA结合的辅助因子结合，调节胶原蛋白、基质金属蛋白酶等纤维化分子的表达，从而促进组织器官的纤维化形成。Smad3的靶向破坏与细胞对TGF-β1的反应减弱有关。有研究表明，在肝星状细胞中，维生素D通过VDR和Smad3之间的基因组拮抗作用抑制TGF-β1/smad3信号通路来阻断促纤维化基因的表达，从而起到抗纤维化的作用[28]。这一研究提示维生素D通过VDR信号通路可以预防肝纤维化的发生。为了明确维生素D是否能预防IBD肠纤维化及其相关机制，Tao等[29]进行了一项小鼠结肠炎模型研究，该研究结果显示，与未补充维生素D的小鼠相比，补充维生素D的小鼠结肠组织黏膜、黏膜下层和浆膜区域中的胶原沉积及总胶原生成量明显减少；同时发现，2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠结肠组织中TGF-β1和Smad3磷酸化水平升高，而经不同剂量维生素D补充治疗的小鼠结肠上皮下肌纤维母细胞（subepithelial myofibroblast，SEMF） 中 TGF-β1 和 Smad3 的mRNA水平显著降低，并呈剂量依赖性。同时，在用特异性siRNA敲低VDR表达的小鼠结肠SEMF中，1,25（OH）2D3并不能下调TGF-β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原α1基因 mRNA的表达，表明 1,25（OH）2D3对于TGF-β1/Smad3信号通路及促纤维化基因表达的抑制效应依赖于其受体VDR，提示VDR信号通路可能成为IBD相关肠纤维化的新的治疗靶点。然而，根据目前现有的研究，维生素D对于IBD的治疗效应仍不明确，VDR与Smad3信号通路之间的相互作用机制尚不清楚，需要大量的体内外试验来进一步探索。

2.2 肠EMT途径 越来越多的研究表明，1,25（OH）2D3可能会通过影响组织器官的EMT过程来预防纤维化的发生。既往研究表明，在小鼠单侧输尿管阻塞模型中，使用小干扰RNA敲低VDR可以模拟TNF-α促进EMT发生的过程，而VDR配体骨化三醇可逆转敲低VDR引起的EMT。并且，与对照组相比，晚期服用活性维生素D也能有效恢复VDR的表达，同时抵消TNF-α和TGF-β1对EMT的促进作用，从而减少胶原蛋白的沉积及减轻输尿管阻塞[30]。一项脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺损伤动物模型研究显示，维生素D处理可降低LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮间充质生物标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达[31]；该研究通过体外实验证实，1,25（OH）2D3可以促进TGF-β刺激的原代人Ⅱ型肺泡上皮细胞中上皮细胞标志物的表达，同时抑制间充质细胞标志物的表达，从而抑制EMT；VDR拮抗剂干预可以消除维生素D对EMT的抑制作用。这一研究表明维生素D对于EMT的抑制效应依赖于VDR。同样，Fischer等[21]发现维生素D活性剂骨化三醇可抑制TGF-β诱导支气管上皮细胞（BEAS-2B）发生EMT。Yang等[20]的研究证实了 1,25（OH）2D3可通过 TGF-β/Smad途径减弱高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT和细胞凋亡。尽管目前没有关于维生素D对肠纤维化形成中对EMT影响的直接研究报道，但是EMT是机体所有组织发生纤维化的关键。因此，根据以上的几项研究结果，可以推测维生素D及其类似物可能通过抑制EMT的发生，发挥预防肠道纤维化的作用，但是仍需相关的直接研究证据来支持以上推测。

2.3 肠成纤维细胞活化途径 肠纤维化的主要发生机制是ECM过度沉积，肠成纤维细胞激活后转化而来的肠上皮下肌成纤维细胞被广泛认为是ECM的主要来源。因此，成纤维细胞的活化是发生纤维化的重要步骤，抑制肠成纤维细胞的活化可成为治疗肠纤维化的靶点之一。一项临床研究发现，健康结肠组织中成纤维细胞表达VDR，并且证实其配体1,25（OH）2D3可调节与基质成纤维细胞的黏附、迁移、伤口愈合和基质重塑、趋化因子产生和炎症反应功能相关的1 000多个基因的表达；同时，1,25（OH）2D3能降低成纤维细胞重组胶原纤维和收缩胶原凝胶的能力，而胶原凝胶的重组和收缩胶原凝胶的能力是成纤维细胞活化的两个特征[32]。因此，笔者推测1,25（OH）2D3通过VDR调节成纤维细胞的生物学特性相关基因的表达，维持体内稳态，从而间接预防肠纤维化。

2.4 CTGF途径 CTGF是由成纤维细胞在TGF－β1的刺激活化作用下产生的一种强有力的促纤维化细胞因子，作为TGF－β1的下游分子，在肠道ECM的积聚过程中发挥重要作用。有研究显示，CD患者肠组织中CTGFmRNA的表达水平是正常肠组织的5倍，而且在严重肠组织纤维化的CD患者中，CTGFmRNA的表达水平升高更显著，这表明CTGF在IBD相关肠纤维化的发生中可能发挥了重要作用[33]。有研究表明，维生素D可通过下调CTGF在组织中的表达水平从而起预防心肌、肾脏纤维化的作用[34-35]。另外，最近的一项小鼠模型研究表明，1,25（OH）2D3可降低腹膜CTGFmRNA的表达，同时伴随腹膜热休克蛋白47（heat shock protein 47，HSP47）的表达下调，及腹膜组织中胶原的沉积减少，表明1,25（OH）2D3可以通过下调CTGF表达，减少HSP47的积聚，进而减少胶原的异常沉积，从而起到抗腹膜纤维化的作用[36]。HSP47是一种位于内质网的胶原特异性分子伴侣，在多种类型的细胞和组织中，HSP47的表达与胶原的表达密切相关[37]，是治疗纤维化疾病的一个潜在靶点。1,25（OH）2D3作用后CTGF及HSP47的一致变化趋势，提示1,25（OH）2D3下调CTGF，可能通过抑制HSP47积聚，进而预防纤维化的发生。CTGF是ECM沉积的关键分子，它在IBD相关肠纤维化中有较高的表达，其表达水平与维生素D补充治疗存在负相关性。因此，笔者推测，在肠道中补充维生素D可能通过抑制肠组织中CTGF的表达，预防肠纤维化的发生。另外，有研究称CTGF生物学效应较为单一[38]，而TGF-β的生物学作用比较复杂，并且影响多种不同的细胞类型，因此CTGF可有望成为选择性预防IBD纤维化的有效靶点。

2.5 保护肠道黏膜屏障及抗菌作用 另外，有研究认为IBD相关肠纤维化的形成与肠道屏障功能的破坏相关：遗传易感性的个体在外界各种因素的刺激下导致肠道黏膜受损，肠道通透性增加，肠道菌群移位，引起食物及肠道细菌等抗原对肠道黏膜直接刺激，导致炎症因子释放，促进肠道间充质细胞向分泌ECM的肠肌成纤维细胞转化，导致ECM在肠壁的过度沉积，最终形成肠纤维化。因此，维持肠道黏膜屏障的完整，可以预防肠纤维化发生。研究表明，1,25（OH）2D3可通过上调紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的表达来增强肠上皮细胞间的紧密连接，维持肠道黏膜屏障的完整性，阻止细菌移入肠壁，避免肠黏膜下层直接接触细菌及其产物，进而间接抑制肠纤维化的发生[39]。同时，研究表明1,25（OH）2D3激活VDR后，可以直接作用于单核细胞诱导抗菌蛋白表达的基因位点，从而增强其杀菌作用[40]。据报道，CD的小肠狭窄常发生在携带核苷酸结合寡聚化结构域蛋白 2（nucleotide-binding oligomerization domain 2，NOD2）基因多态性的个体中，其产物是能够识别细菌产物胞壁酰二肽（MDP）的细胞内模式识别受体，而MDP是细菌肽聚糖中普遍存在的一种成分[41]。1,25（OH）2D3与VDR结合能够诱导多种类型细胞的NOD2表达，增强对革兰阴性菌及革兰阳性菌的产物胞壁酰二肽的识别，同时诱导NOD2的下游关键转录因子NF-κB的活化入核，从而上调抗菌肽防御素β2的表达，起到杀灭病原菌的作用。基于上述研究结果，笔者推测维生素D能够通过保护肠道屏障，增强机体对于病原菌的杀菌能力，从而减少细菌对肠黏膜的刺激，发挥间接预防肠纤维化的作用。

虽然结肠中存在大量的微生物，但由于小肠远端即回肠末端存在一个门控系统，可以抑制微生物向小肠上段过度生长，所以小肠中的细菌数量非常有限。Paneth细胞位于小肠隐窝底部，分泌防御素和溶菌酶，在炎症刺激下富集于小肠远端，与肠道上皮的紧密连接共同形成肠道抗菌屏障，保护宿主免受内源性病原体的侵袭，并调节小肠管腔内定植菌的组成，在维持肠道稳态中发挥重要作用[42]。目前有研究假说认为小肠CD是由于Paneth细胞防御素缺乏，造成肠道抗菌屏障破坏及肠道菌群移位，进而导致一系列肠道炎症反应[43]。研究发现，VDR在Paneth细胞富集的回肠末端高表达，这种独特的肠道表达模式提示，肠道中的VDR信号可能通过调节肠道中的Paneth细胞及其防御素的分泌，从而抑制小肠中微生物的过度生长[44-45]。与这些观点相一致，Wu等[46]在四氯化碳诱导的肝损伤小鼠模型研究中发现，与野生型小鼠组相比，敲除肠黏膜上皮细胞中VDR的小鼠组显示出Paneth细胞防御素和溶菌酶的产生减少、肠道微生态失调及更严重的肝纤维化。既往的研究表明，小肠CD中Paneth细胞-防御素的减少与Wnt信号转录因子4（Tcf-4）的减少相关，Wnt信号可通过β-连环蛋白/Tcf-4转导途径诱导肠道中Paneth细胞的分化成熟[42]。因此，笔者推测在小肠CD中，维生素D信号可能通过上调Wnt/Tcf-4信号通路调节Paneth细胞及其防御素的产生来发挥抗菌效应，从而间接起到抗纤维化的作用。

3 总结与展望

据研究，VDR在IBD患者肠黏膜上皮细胞中的表达水平显著低于正常人，维生素D可减轻IBD疾病活动性，而这一作用依赖于VDR信号通路。目前研究证实，维生素D可以通过活化VDR抑制TGF-β1和CTGF等促纤维化因子信号通路、肠EMT、成纤维细胞的活性及增强机体的杀菌能力等途径，在众多纤维化疾病中起到预防和治疗的作用。而TGF-β1和CTGF促纤维化因子信号通路的激活、肠EMT、成纤维细胞活化及肠道菌群变化是机体组织发生肠纤维化的重要环节，因此笔者推测维生素D可能同样通过上述几种途径在IBD中发挥预防和治疗肠纤维化的作用，可被推荐用于IBD相关肠纤维化的治疗中，至少作为一种辅助治疗手段减缓肠纤维化的发生、发展。但是目前的研究多集中于其他组织细胞和动物模型研究，有关维生素D治疗IBD相关肠纤维化的直接研究仍然很少，因此需要大量、更直接全面的基础和临床研究，为临床上维生素D治疗IBD相关肠纤维化提供循证依据。

总之，目前在分子水平上，维生素D防治IBD相关肠纤维化的机制尚未完全明了，在临床上，缺乏相关的临床研究证据。因此，对上述机制的深入研究将为IBD相关肠纤维化的新治疗方法的研发奠定基础，将来维生素D有望作为一种新兴的治疗IBD相关肠纤维化的药物。