Wnt信号通路在肺间质纤维化中的研究进展

纵加强，韩志海

间质性肺疾病（interstitial lung diseases，ILDs）是一组以肺间质及肺泡腔损害为主的疾病，组织学上表现为肺泡壁被各种炎症细胞、纤维蛋白和正常肺泡壁增殖的细胞所浸润。ILDs 肺纤维化过程中涉及多条信号通路，其中Wnt信号通路广泛参与肺纤维化过程，机体正常的生理过程中能够促进肺的生长和发育，而在损伤修复过程中可被过度激活导致肺纤维化，其中特发性肺纤维化（idiopathic pul‐monary fibrosis ,IPF）的研究最为成熟，如特征性的胸膜下纤维化可能与Wnt5a的受体或共受体ROR2有关、β-catenin 的核积聚是肺纤维化共同的特征、经典的Wnt 信号通路在细胞及动物纤维化模型中普遍被检测到了异常激活；继发性肺纤维化如新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）、结缔组织病（connective tissue dis‐eases，CTD）及烟雾相关肺纤维化也发现Wnt 信号通路过度激活。另外基于Wnt 信号通路的治疗也有了一定的进展。

1 Wnt信号通路

Wnt 信号通路可分为经典Wnt 信号通路（即Wnt/β-catenin 信号通路）和非经典Wnt 信号通路。其中，β-catenin 是介导经典Wnt 信号的关键分子，在胞内由APC、Axin 及GSK-3β 等组成的β-catenin降解复合体控制，转入核内可促进靶基因的转录[1]；非经典Wnt 信号通路主要包括Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路[2]。

经典与非经典Wnt 信号通路的区别不仅在于是否依赖β-catenin分子，非经典Wnt信号通路还需要不同的G蛋白进行信号转导[3]；两者相互影响，非经典Wnt 信号通路不仅可以通过影响GSK 的磷酸化调节经典Wnt信号，还可以与Hippo-YAP/TAZ 信号通路相互作用，增加经典Wnt信号通路传导抑制剂的分泌，如Dickkopf-1（Dkk-1），Wnt5a/b 等。此外，Wnt-FZD 信号传导的过程很大程度上取决于细胞内环境中不同Wnt 配体的相对密度，LRP5/6 及Dvl 的选择作用也决定信号传导方向[4]。因此两者整体效应在通路水平上可能最终取决于多种配体-受体连接和不同途径的综合影响。

病理条件下Wnt信号通路失调，当修复过程转变为慢性时可导致纤维化发生，表现为持续损伤修复、机体细胞重新编译、细胞外基质异常沉积，最终导致功能障碍。 目前研究提示异常的Wnt/β -catenin 信号传导可能是心脏、肝脏、皮肤、肺等纤维化中关键的信号传导途径，有可能成为纤维化疾病治疗的新靶点。

2 Wnt信号通路与特发性肺纤维化

IPF 的组织学特征是进行性肺部瘢痕形成和出现普通间质性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP），如上皮下成纤维细胞灶、胸膜下肺纤维化和网格样改变，目前认为肺成纤维细胞的过度增殖是纤维化发生的最直接原因，动物实验发现纤维灶中约33%的成纤维细胞来自上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT） ，约20%来自骨髓干细胞[5]，间充质干细胞及其他来源约占剩余50%。

EMT 是肺纤维化关键一环，支气管-肺泡连接处和胸膜下上皮异常增殖分化为成纤维细胞，这种特殊区域的改变可以解释IPF/UIP典型的胸膜下网格样改变。Liu等人[6]的研究结果也表明小鼠胸膜间皮细胞与胸膜下区域的肺成纤维细胞可互相干扰，促进间皮-间质转化及成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，同时激活Wnt/β-catenin、TGF-β1 和CD147 信号通路，促进肺纤维化。有研究还发现在气道损伤诱导的II型肺泡上皮细胞中，经典Wnt信号被激活，进而促进间质成纤维细胞的增殖和肺组织重塑，短暂性重塑可消退，而持续性重塑会导致肺纤维化[7]；其次在肺内皮细胞中经典的Wnt/β-catenin 信号会使血管周围成纤维细胞向肌成纤维细胞样转变，导致细胞外基质（extracellular matrix ，ECM）积累和组织硬度增加，进一步促进肺纤维化[8]。

经典Wnt 信号也参与间充质干细胞向成纤维细胞的分化。TGF-β1可使肺驻留的间充质干细胞驱动分化为肌成纤维细胞，伴随p-GSK-3β 明显上调，β-catenin 持续累积，加快基因转录，增加ECM的沉积，而ICG-001（β-连环蛋白/CBP 特异抑制剂）可阻断上述改变[5]。另外一些成熟细胞也可以提供干细胞功能，在特定的微环境下，Wnt 信号通路控制细胞的增殖和分化。如肺泡成纤维细胞可分泌Wnt5a 及少量一种或两种其他Wnt，包括Wnt2、Wnt2b、Wnt4 和Wnt9a，少数位于单个成纤维细胞附近的Wnt靶标Axin2（+）肺泡II型细胞可维持其干细胞活性，脱离该微环境便分化为肺泡I 型细胞[9]；同样Axin2（+）肌成纤维祖细胞在损伤后优先产生肌成纤维细胞[10]，分泌大量ECM，促进肺纤维化。

上述研究均证实了Wnt信号通路在IPF中的致纤维化作用。治疗上尽管进行了许多临床前的研究，如上述ICG-001、Linderapyrone（抑制TCF/β -catenin 活性）、Wnt-C59（减少β-连环蛋白和NF-κB的相互作用）等，但临床中目前IPF并无Wnt相关的特效治疗药物，上述发现既有助于解释IPF 发病的机制，也可为进一步寻找新的治疗靶点提供参考。

3 Wnt信号通路与继发性肺间质纤维化

3.1 Wnt信号通路和COVⅠD-19 相关肺纤维化 研究发现去年开始流行的COVID-19患者在急性期间部分胸部CT 已经显示出肺纤维化改变[11]，随后我国学者进行的世界首例COVID-19大体解剖及后续学者进行的肺穿刺病理也均提示不同程度的肺纤维化改变[12]。

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome ，ARDS）是继发性肺纤维化最重要的危险因素之一，有研究数据显示约14.8%[13]COVID-19 患者最终发展为ARDS。多项关于COVID-19 的研究发现参与肺纤维化的细胞因子TGF-β、IL-6、TNF-α等增加[14]，进一步研究表明TGF-β 和经典Wnt 信号通路以正反馈方式相互上调，在COVID-19患者中，TGF-β 刺激经典Wnt 信号通路过度激活，导致肺纤维化和肺部感染的风险增加[15]。

在脓毒症或ARDS 中，Wnt5a 信号激活在肺部炎症和纤维化中起关键作用，Wnt5a 是成纤维细胞增殖的重要调节剂，具有抗凋亡的作用，可促进ECM 沉积[16]；Wnt11 蛋白可通过调节NF-κB 活性，抑制炎症性细胞因子的诱导[17]，Wnt5a 和Wnt11 对炎症反应具有彼此相反的功能。为了研究Wnt5a和Wnt11与COVID-19的相关性，Eun等人[18]收集了SARS-CoV-2 检测阴性的正常人、SARS-CoV-2 患者、SARS-CoV-2 ARDS 患者以及感染SARS-CoV-2住院后出院患者的血液，发现Wnt5a 可促进炎症，是预示SARS-CoV-2 ARDS 患者预后不良的指标；Wnt11 可有效抑制炎症反应和细胞因子的产生，可能是疾病生存能力良好的指标。

最新研究表明COVID-19血清中TGF-β的显著增加，使Wnt5a 表达上调[19]。因此，单纯中和Wnt5a效果可能不佳，需进一步研究Wnt与TGF-β 信号通路在COVID-19 患者中关系，在通路水平上寻找可能早期抑制纤维化发展的治疗措施。

3.2 Wnt 信号通路在结缔组织病相关肺纤维化中的作用 肺是CTD 常见的侵袭器官, ILDs 已成为CTD患者发病和死亡的主要原因[20]。

研究发现系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）最常与ILDs 相关。Christian 等人[21]发现在SSc患者皮肤中，成纤维细胞β-catenin的核水平显著增加，并且与Wnt1 和Wnt10b 的表达增加有关；βcatenin 的特异性缺失则抑制博来霉素诱导的皮肤纤维化。 Anna 等人[22]也发现SSc 相关的晚期肺纤维化患者中肺成纤维细胞灶、纤维母细胞、气道和肺泡上皮细胞中核β-catenin蓄积，促进肺成纤维细胞的迁移和增殖。上述可见β-catenin 是SSc 中成纤维细胞活化和组织纤维化的关键因素，经典Wnt信号通路参与SSc相关肺纤维化。

为证实Wnt作用，使用重组sFRP4（Wnt通路拮抗剂）可降低β-catenin 和α-SMA 表达的水平以及肌成纤维细胞的数量。最近的研究也发现SSc 真皮成纤维细胞中，microRNA27a-3p 水平显著升高，从表观遗传上降低了sFRP1 水平，导致Wnt 信号传导增强[23]。这表明同其他组织纤维化一样，药物或通路抑制剂可通过干扰Wnt 信号抑制成纤维细胞增殖、分化和EMT来控制肺纤维化。

3.3 Wnt 信号通路和烟雾吸入致肺间质纤维化目前研究表明香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以显著增加人胚肺成纤维细胞α-SMA的表达，表明CSE可以促进肺成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化[24]。火灾时烟雾吸入性急性肺损伤（smoke induced acute lung injury，SI-ALI）涉及炎症反应、氧化应激等，后期也发现了纤维化改变。Feng 等人[25]使用自制的烟雾发生器发现大鼠烟雾吸入后第28 天肺组织出现明显的胶原蛋白沉积；LC等人[26]在大鼠上证明了随着时间的延长，烟雾吸入后的肺组织中马松染色及天狼星红染色显示胶原沉积逐渐增加。因此，作者推断CSE及SI-ALI导致的纤维化与IPF 的发生可能有相同的机制，都涉及Wnt信号通路的过度激活。

为了验证上述观点，Marco将A549细胞暴露于CSE后，Wnt受体过度表达，经典Wnt信号通路被激活，EMT相关的基因及蛋白表达失调，如波形蛋白、MMP-2、MMP-7、TGF-β1，趋化因子CCL-2表达显著增高，A549 细胞也逐渐变成细长形状的成纤维细胞且具有更高的迁移能力[27]。这表明从细胞层面上CSE 通过Wnt信号通路参与EMT，诱导各种促纤维化基因的表达，并促进成纤维细胞的迁移，加速肺纤维化的发生。Yumei 也发现人皮肤瘢痕组织的成纤维细胞（keloid fibroblasts, KFB）中β-catenin表达明显增加，敲除β-catenin 或Wnt2 基因都会抑制经典Wnt 信号通路和细胞周期蛋白cyclin D1 表达，KFB 细胞的生长明显变慢，细胞倍增时间显著延长，并抑制纤维化表型[28]。上述研究说明无论在肝脏、肾脏、皮肤，都有证据表明Wnt信号通路的激活促进纤维化是一个普遍的现象，为火灾烟雾相关的研究奠定基础。

目前为止，火灾烟雾吸入性肺纤维化相关报道较少提及，与Wnt 信号通路相关的文献很少，考虑CSE 与火灾烟雾成分的差别，肺部微环境与皮肤、肾脏等的差异，需要进一步通过细胞及动物实验探索Wnt/β-catenin 信号通路与烟雾吸入性肺纤维的关系，为寻找相关治疗提供可能。

3.4 经典Wnt 信号通路参与百草枯中毒引起的肺纤维化 研究发现百草枯纤维化肺组织中Wnt/βcatenin 信号分子，如MMP - 2、β - catenin、Wnt3a、Wnt10b、Cyclin D1 和WISP1 等表达水平显著升高，肺上皮细胞和成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，而这一作用在体内外均可被Wnt 信号通路的拮抗剂Dkk-1抑制。更加说明了Wnt信号通路参与肺纤维化的普遍性。

4 Wnt信号通路相关治疗

4.1 Dkk-1 Dkk-1 是天然的Wnt信号通路拮抗剂，通过结合LRP5/6、Kremen-1/2拮抗β-catenin信号传导，已被证实在细胞实验及动物实验可以抑制纤维化相关分子的表达，如α-SMA、胶原蛋白，减轻肺纤维化及肝脏纤维化[6]。

Alfiya 发现Dkk-1 过表达可改善由I 型TGF-β受体信号诱导的皮肤纤维化，并在其他TGF-β依赖性动物模型中预防了纤维化。Dkk-1的过度表达在Tsk-1 小鼠的炎症模型以及炎症非依赖性模型（如纤维化）中阻止了纤维化。Dkk-1 表达水平降低可导致人纤维化中经典Wnt 途径的激活，目前Dkk-1被研究作为其他疾病的潜在治疗靶点（如肝纤维化），与靶向单个Wnt 蛋白相比，Dkk-1 可以更广泛地抑制经典Wnt 信号通路。因此，Dkk-1 及其类似物可能是通过Wnt信号途径抗纤维化的有效手段。

4.2 sFRPs sFRPs 也是一种天然的拮抗Wnt 的分泌蛋白，可抑制Wnt 与Wnt 受体之间的相互作用，从而阻断Wnt 信号的传导。在肛门括约肌损伤相关的纤维化的兔模型中，切开肛门外括约肌（ex‐ternal anal sphincter, EAS）后纤维组织替代，免疫组化发现β-catenin 活化，纤维化标志物水平增加了1.5～2 倍，局部注射sFRP-2 可减弱β 连环蛋白的活化和纤维化，EAS 肌肉含量和功能得到显著改善[29]；sFRP-1 基因敲除的小鼠随着年龄的增长也出现了明显的心脏纤维化及心功能恶化[30]。因此sFRPs 的异常分泌会导致纤维化的发生，抑制sFRPs可能会有效抑制纤维化。

4.3 阻断Wnt信号传导的药物 从阻断Wnt信号传导的角度，有学者认为最有效的靶标是TCF 与βcatenin 的复合物，因其是信号传导的关键连接点，并在通路下游起关键作用。尽管有学者提出几种该复合物的抑制剂，如PKF115-854 和CGP049090，但由于其表面不易被抑制剂取代，因此还需进一步研究。研究显示，Wnt途径中最特异性的小分子抑制剂可能是IWP-2，可高度选择性灭活Porc，从而阻断Wnt 蛋白酰化2，但目前该药物的应用仅限于细胞培养实验。

5 总结

大量的证据支持Wnt 信号通路是器官纤维化的重要原因，无论是IPF 还是继发性的纤维化改变，Wnt信号的激活可能是不同的肺纤维化疾病的共同特征，同一种疾病也可同时涉及经典及非经典的Wnt 信号通路。动物实验中Wnt 信号抑制剂干预纤维化是进一步开发减弱或消除器官纤维化的药物的重要基础。因此，进一步探索Wnt信号通路与其他致纤维化通路间相互的关系至关重要，如TGF-β 与Wnt 信号通路，未来需要更多的临床前及临床研究来加以论证。