药物心脏毒性模型建立与评价的研究进展

毛鑫羽,黄宇虹,王保和

随着药物研究与开发的不断发展,药物的安全性问题愈来愈受到关注,药物安全性的相关基础研究广泛开展。虽然大部分药物上市后被证实安全有效,但仍有部分药物在临床应用的安全方面存在隐患[1]。要正视药物的毒性,选用合适的生物毒性模型,用科学客观的数据对药物的毒性进行正确评价。

药物毒性主要体现在对心、肝、肾等主要脏器的损害方面,其中药物心脏毒性是指药物在相对小的剂量和相对短的时间内对心脏生理功能产生影响或损害心肌的药效反应[2]。心脏毒性反应多会导致心肌病的发生,严重影响心肌及心脏电生理功能[3],心脏安全性是药物研发阶段临床应用前及上市前后需要持续考量的重要指标,如何详细全面地评价药物心脏安全性、正确认识药物心脏毒性,是药物安全性评价的重点[4]。

在广泛开展的药物安全性评价基础研究中,模型的建立是进行进一步医学试验和假说的基础,具有不可替代的重要意义,掌握药物心脏毒性的临床试验前筛选技术,找到能够快速、准确、敏感地反映外源性化合物对生物体毒性作用的评价模型已经成为药物安全性评价亟待解决的重要问题[5-6]。现对药物心脏毒性模型的建立与评价进行综述。

1 体外模型

1.1 离体心脏 离体大鼠心脏模型已经广泛用于心脏缺血再灌注损伤等相关研究,或应用于监测药物对心脏功能和节律的影响等研究中。Robert[7]建立了离体大鼠心脏的短期模型,通过左室压反映药物的心脏毒性。1895 年德国生理学家Oscar Langendorff 首次成功制备了哺乳动物的离体心脏灌流装置[8],命名为Langendorff 离体心脏灌流模型。K-H 灌流液经由主动脉根部灌注冠状动脉循环,从冠状静脉窦流入右心房,与生理状态下的血液灌流方向相反[9]。正常情况下,大鼠立体心脏经Langendorff 装置灌流后数秒即可恢复自主搏动,20 min 左右心室内压趋于稳定,心率及节律稳定,偶尔发生心律失常[10]。通过建立稳定的Langendorff 离体心脏灌流模型,应用潜在毒性药物对其进行干预,对离体心脏的心率、PR 间期、QT 间期等心电图指标进行记录,观察发生心律失常的风险,以评价药物的心脏安全性。离体心脏灌注模型具有可重复性强、敏感性高等特点,广泛应用于心血管领域基础研究中,但离体心脏模型的制备受灌注液、灌注压力、流量及灌注操作等多种主观因素影响,不易标准化[11],且啮齿类动物及犬等动物的心脏结构、电生理以及遗传学相关因素与人类的差异,使其不能完全准确预测药物对人体潜在的心脏毒性,具有一定的局限性[12-14]。

1.2 人诱导多能干细胞分化的心肌细胞 既往采用人类ether-a-go-go 相关基因(hERG)稳定转染的HEK293 细胞系作为评价药物心脏毒性的体外细胞模型[15],而心肌细胞由于具有部分电生理特性且操作简便的特点,如今被广泛应用于药物心脏安全性评价方面。来源于人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)表达肌丝蛋白,具有与原代心肌细胞相类似的电生理特性,并且表达多个与人心室肌细胞动作电位相关的离子通道,为药物心脏毒性的评价提供了新的体外模型[16-18]。通过对hiPSC-CMs 的长期体外培养,可以检测出引起药物心脏毒性的多条可能途径及机制,包括引起氧化应激、线粒体损伤、改变细胞内信号通路、改变Ca2+调节等[19-20]。可以通过hiPSCCMs 模型检测药物的心脏电生理毒性、结构性毒性等,为药物安全性监测提供了细胞水平的模型。

干细胞诱导分化的心肌细胞在药源性心脏毒性体外评价研究中应用广泛。相对于原代大鼠心肌细胞,人诱导干细胞分化的心肌细胞作为药物的心脏毒性评价模型更为准确敏感。有研究者通过对比原代大鼠心肌细胞与hiPSC-CMs 两种细胞模型,以探寻更优的心脏毒性体外评价模型。通过应用RTCAxCELLigence技术对细胞的不规律搏动频率或振幅进行监测,同时运用高内涵细胞成像法在给药后多个时间点检测线粒体膜电位,并观察不同浓度药物对原代大鼠心肌细胞及hiPSC-CMs 的影响,证实hiPSC-CMs 对药物心脏毒性的评价更加敏感,在用药早期、低浓度用药时即可检测到药物对细胞的影响[21]。利用人胚胎干细胞分化的心肌细胞能够建立一种可行的体外心脏毒性评价模型,通过联合实时细胞分析法(real-time cell analysis cardio,RTCA Cardio)以及高内涵细胞成像技术,可连续动态记录细胞的增殖、毒性及细胞状态,对药物的心脏毒性进行快速、灵敏、准确的评价,并且可以作为一种高通量筛选工具用于临床前药物心脏毒性早期筛选[22-24]。

hiPSC-CMs 与成熟心室肌细胞存在些许差异,主要表现在成熟度方面。hiPSC-CMs 高表达超极化激活环核苷酸门控通道及L 型钙通道,低表达内向整流型钾离子通道2.1(Kir2.1)及钠通道,动作电位去极化速度较成熟心室肌细胞减慢,时间略长[25-26]。Campbell等[27]通过诱导hiPSC 产生心肌细胞、成纤维细胞及冠状动脉内皮细胞,将这几种细胞按照人心脏中的比例共同培养,完成了心脏立体细胞培养技术的构建。Correia 等[28]也通过一种全新的培养模式建立了高纯度hiPSC-CMs 立体聚集体模型,并证实相比于平面培养的心肌细胞,立体细胞模型在细胞间相互作用等对各方面基因表达有明显的影响,提示hiPSC-CMs 立体模型对药物评价方面有更准确的预测及参考价值。应用人诱导多能干细胞分化获得的心肌细胞可以减少不必要的动物实验,同时可以高通量评价药物对心脏功能性和结构性的影响[18],将纯度更高、成熟度更高的hiPSC-CMs 及心脏立体培养技术应用于药物的研发及早期安全性评价,可以很大程度上降低药物研发成本,减少种属差异,增加对药物心脏毒性预测的敏感性与准确性,并即将成为临床前药物心脏安全性评价的重要体外模型[29-30]。

2 动物模型

目前,动物模型的实验对象主要包括大鼠、小鼠、兔等,主要目的是寻求与人类结构和发病过程相似的动物模型,便于更好地进行实验研究。现已建立了大鼠或小鼠、兔、猪、犬和斑马鱼等用于预测药物心脏毒性的模型,这些模型已用于药物临床前毒性的评价。

2.1 鼠、兔 大鼠、小鼠及家兔等啮齿类动物是当前药物安全性评价在体模型主要用到的实验对象,可以通过兔耳缘静脉注射阿霉素2 mg/kg 建立早期心脏毒性模型,或通过腹腔注射阿霉素法复制大鼠心脏毒性模型,采用梯度剂量间隔给药造模[31-33],其中张珊等[34]采用阿霉素诱导大鼠心脏毒性模型,盐酸阿霉素2.5 mg/kg 对大鼠少量多次腹腔注射,每周1 次,累积总药量15 mg/kg。亦有研究者通过多柔比星(DOX)4 mg/kg小鼠腹腔注射建立心脏毒性模型[35]。

通过大鼠或小鼠、兔等啮齿类动物建立药物体内心脏毒性模型,饲养方便,易于复制,可完成药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程,与临床上早期药源性心脏毒性反应相似,在药物心脏毒性临床前评价方面广泛应用,对早期药源性心脏毒性的评价具有重要意义。

2.2 斑马鱼 近年来,斑马鱼在国内外已成为一种热门的药学研究工具,被用来建立各种疾病模型进行药物活性、毒性的高通量筛选以及药物代谢等方面的研究[36-37]。

张利军等[38]选用斑马鱼的胚胎作为实验动物,对药物的心脏毒性进行评价,通过高通量筛选建立药物心脏毒性斑马鱼模型。研究以4 种已知心脏毒性阳性药物作为试验药物,通过观察斑马鱼胚胎心血管系统的形态学改变,测量静脉窦-动脉球(SV-BA)距离及心率来评价药物心脏毒性作用的特点,证明斑马鱼作为药物心脏毒性评价模型的准确性及可行性。赵梦岚等[39]选用状态好的48hpf(hours post fertilization)斑马鱼胚胎,设立低、中、高浓度乌头碱进行干预,并采用0.1%二甲基亚砜(DMSO)作为阴性对照,于给药后12 h、24 h、48 h 观察斑马鱼胚胎的存活率、生长情况以及心脏舒缩功能,记录斑马鱼胚胎的心包水肿情况以及心率、心排血量等各项心功能指标。研究证实10 μmol/L 中等浓度剂量乌头碱给药48 h 后,斑马鱼胚胎心包水肿明显,心脏舒缩功能障碍,具有明显的心脏毒性,但不致其死亡,确立选用10 μmol/L 浓度乌头碱干预斑马鱼胚胎建立早期心脏毒性模型,并于后续研究中应用。徐卓然等[40]运用64.4 μmol/L 阿霉素对24hpf 斑马鱼胚胎进行干预,建立斑马鱼心脏毒性模型,并对其机制进行了探讨。

斑马鱼模型克服了其他模式生物在研究中的局限和弊端,具有身体透明、基因同源、快速发育、体型微小、饲养便捷等特点[41],可以通过观察药物对斑马鱼的作用进而预测其对人体的影响[42],使斑马鱼成为了药物心脏毒性研究的理想动物模型。

3 心脏毒性模型的评价

心脏毒性模型建立后,其模型的评价显得尤为重要。细胞模型主要通过应用RTCAxCELLigence 技术或高内涵成像技术检测线粒体膜电位来评价药物对心脏毒性的影响,对于动物模型目前主要采用以下几个方面对心脏毒性模型的建立进行评价:①形态学观察。斑马鱼心脏毒性模型可以通过显微镜以及荧光倒置显微镜观察斑马鱼胚胎的状态、心脏的形态结构、心脏收缩与舒张情况以及心包水肿情况等,对斑马鱼心脏损伤的表型进行评估[39]。②心率及心功能监测。动物模型可以对大鼠、兔或斑马鱼的心率、心排血量、每搏量、血流动力学等心功能指标进行检测,反映药物对心脏早期的毒性反应,更深入的研究可以通过荧光蛋白基因标记实时监控斑马鱼胚胎心脏发育过程中特定基因的表达情况及表达位置,以更准确地定性、定量对药物的心脏毒性进行评价[40]。③超声心动图。通过心肌背向散射积分技术及小动物超声仪器有效监测模型的建立,评估模型的效果,将大鼠或小鼠麻醉脱毛后,通过Vevo2100(Visual Sonics Inc)仪器对其进行心脏超声检查,检测射血分数(EF)、左室缩短分数(FS)、左室压最大上升速率(+LVdp/dtmax)以及心脏构型及血流的变化,评价药物对心脏的毒性作用[31]。通过定量组织速度成像(QTVI)技术与小动物超声仪器对早期药物心脏毒性模型的建立进行评价,可以根据QTVI参数的变化来调整造模过程中的用药剂量,使建立的药物心脏毒性模型的病理变化程度趋于一致[43]。根据不同的心脏毒性模型,选取相应的方法对模型的建立及药物的心脏毒性进行评价。

4 小 结

药源性心脏毒性作为各类药物研发及临床应用阶段需要考量的重要问题,对药物心脏毒性的早期监测十分重要,国内外药物毒性评价研究迅速发展,选取与人类心脏毒性反应相似的动物或细胞模型,建立适合的药物心脏毒性评价模型,对药物的心脏安全性评价具有重要的意义。

离体心脏模型可以清晰敏感地模拟药物对心脏的毒性,易于观察及早期发现,但造模复杂、受操作影响不易标准化,实验动物心脏结构及电生理功能与人体相较有一定的差异;hiPSC-CMs 建立早期心脏毒性模型与人类心肌细胞具有相似的电生理特性,敏感性高,有利于高通量早期评价药物的心脏毒性,且立体细胞模型对于评价药物心脏毒性可能更加准确,成熟度方面有待进一步提高;啮齿类动物心脏毒性模型建立简便,饲养方便,可以运用超声心动图对模型的建立进行评价,并可以通过测量结果调整造模过程中的用药剂量;斑马鱼作为一种与人类基因同源的动物,体型较小,身体透明,复制方便,建立药物心脏毒性模型,可以直观地对心脏结构形态、舒缩状态等情况进行观察,实时监测药物对斑马鱼心率及心功能的影响,进而预测药物对人体心脏安全性的影响,是较理想的心脏毒性模型动物。根据心脏安全性评价需求,选取并建立合适的心脏毒性模型可以为新药研发及药物早期临床应用方面的进一步研究提供科学依据与思路。