HIF-VEGF-Notch信号通路在血管生成中的作用

王美玲 刘华绪

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院，山东省皮肤病性病防治研究所)，济南，250022

血管是维持组织细胞生长发育、新陈代谢、运输氧气及营养物质等功能所必须的，血管生成在组织细胞的生长发育和机体的某些疾病中都有着重要作用：胚胎时期参与胚胎的发育成熟；病理情况下参与伤口愈合、免疫、炎症反应、肿瘤的发生以及进展等过程。其过程涉及许多种信号通路，如PI3K/AKT/mTOR、VEGF-VEGFR、PDGF/PDGFR-β、HIF、Notch等。

1 血管生成的组织胚胎学基础

胚胎时期的血管发育称为血管发生(vasculogenesis)，是由起源于胚胎卵黄囊的中胚层细胞——内皮祖细胞(EPCs，也称血管母细胞)逐渐分化成为内皮细胞(ECs)并形成原始血管腔[1]。血管生成(angiogenesis)是指从已有的血管系统中长出新的血管。其过程包含：来自其周围细胞的血管生成信号导致血管扩张和血管通透性增加；胶原酶和基质金属蛋白酶等消化酶使基底膜发生降解；血浆蛋白随后形成富含纤维蛋白的基质；活化的内皮细胞移向该部位，并开始增殖，在增生的毛细血管中形成管腔[2]。最终，在剪切应力的作用下，新形成的毛细血管成为现有循环的一部分。这个过程与很多复杂的分子机制有关[3]。

血管系统的生成主要包括血管芽的形成、尖端细胞(tip cell)的选择、尖端细胞迁移、茎细胞(stalk cells)的增殖以及血管周细胞或血管平滑肌细胞等的共同作用，最终形成稳定的管腔。尖端细胞是由现存的内皮细胞分化发展而来，其后方具有增殖和延长血管网能力并形成管腔样结构的内皮细胞称为茎细胞。尖端细胞具有运动性，侵袭性和高度极化的特点，其丝状突起可以伸展并引导内皮细胞的生长[4]。随着尖端细胞的迁移和茎细胞的增殖，形成管腔和构建血液循环。尖端细胞和茎细胞的生成过程受到血管内皮生长因子(VEGFs)/Notch等信号通路的调节[5]。

2 Notch信号通路

2.1 Notch信号通路概述 1917年有学者首先发现Notch基因的存在。Notch受体、Notch配体和CSL-DNA结合蛋白是Notch信号通路可发挥生物学作用的三个结构域组成。目前已经研究发现四种受体(即Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)和五种配体(即jagged1、jagged2和DLL1、DLL3 DLL4)。Notch配体的DSL(Delta/Serrate/Lag2)区域与受体的相应结构域结合并通过激活下游的一系列反应而产生生物学效应[6]。

Notch信号通路的受体和配体的效应机制都是单次跨膜蛋白，通过细胞之间的直接接触而触发信号级联反应，进而参与多种生理病理过程。当属于特定细胞的Notch(跨膜受体)与属于其邻近细胞的Delta或Jagged(跨膜配体)相互作用时，能激活Notch细胞内结构域(NICD)[7]。NICD随后进入细胞核并调节Notch通路下游许多靶基因的表达，尽管产生了相同的信号(NICD)，但通过Delta激活的Notch-Delta(N-D)信号和通过Jagged激活的和Notch-Jagged(N-J)信号具有不同的动力学效应。因为NICD不对称地调节两个配体的表达：它能抑制Delta的表达，却相反地激活了Jagged，Notch-Delta可以形成一个细胞信号间的双负反馈环，相反，Notch-Jagged信号产生一个细胞间双正反馈环。除NICD的不对称调节外，N-D和N-J信号也可通过糖基转移酶进行差异调节。这些机制最终导致它们在血管生成过程中发挥互补作用[8]。

2.2 Notch信号通路与血管生成 Notch信号通路能通过参与尖端细胞/茎细胞、动静脉的选择、内皮细胞的增殖以及细胞间相互作用和维持血管稳定性等过程来调控血管的发育[9]。通过对小鼠Notch信号相关基因靶向缺失的研究发现，该小鼠表现出多种血管障碍，主要影响血管重塑和动脉形成的过程。Notch1、DLL4和CSL突变导致最严重的血管破裂。仅Notch4基因突变的小鼠血管发育未受影响；而Notch1/Notch4双突变体的小鼠却显示出血管缺陷，比仅缺乏Notch1的小鼠出现的更加严重，这表明Notch1/Notch4的功能是有重叠的。Jagged1缺失也会导致出血和血管生成重建失败而导致死亡，此外，DLL4杂合子缺失也是致命的。DLL4突变体中的血管缺陷包括动静脉畸形、缺乏血管重塑和大动脉塌陷或形成不完全。另外，在斑马鱼实验中，Delta-Notch信号对动脉内皮细胞的分化和大动脉的正常形成也具有重要作用[10]。上述研究说明notch通路在血管发育成熟过程中的作用都是不可缺失的。

3 VEGF概述

3.1 VEGF家族 VEGF包括VEGF-A(是在组织中最常表达的类型)、VEGF-(B、C、D、E、F)和胎盘生长因子(PlGF)。VEGF-A参与了血管生成的调控，本文也主要阐述其在血管生成中的作用[11]。VEGF与其受体血管内皮生长因子受体(VEGFR)相结合而发挥作用，主要包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGF-A的受体主要是VEGFR-1、2，VEGFR-1、2主要在内皮细胞中表达。VEGFR是酪氨酸激酶，在配体二聚作用下自磷酸化，活化后激活下游多种信号。驱动内皮细胞产生多种细胞效应，如迁移、增殖、细胞存活和调控下游基因的表达[12]。

3.2 VEGF与血管生成 在血管系统发育的过程中，VEGFA主要与VEGFR2相结合来调节ECs的迁移、增殖和募集等过程，对于促进血管生成非要重要，当细胞组织接受VEGF的刺激后，ECs产生伪足并向顶端细胞延伸，此时，茎细胞则紧随其后不断增殖和延长，最终共同作用并成为新生血管的主干[13]。通过小鼠的基因靶向研究强调了血管内皮生长因子途径在血液和淋巴血管系统发育中的重要性。VEGF-A或其主要信号受体VEGF-R2的基因缺失导致早期胚胎因为造血和血管发育的几乎完全阻断而死亡(大约胚胎第9天)。类似地，VEGF-C的缺陷导致淋巴管的发育严重阻塞，VEGF-C的主要受体VEGF-R3的缺失导致与血管缺陷相关的胚胎死亡。VEGF-R1的缺失也会导致胚胎死亡，而其他VEGF配体的缺失不是致命的，对斑马鱼的研究也揭示了VEGF在血管系统中的相同作用[10]。

3.3 VEGF与血管生成相关疾病的关系 VEGF在血管生成中的作用是十分重要的，而各种肿瘤的产生也需要血管生成才能提供足够的氧气和营养物质来维持其发生发展，所以VEGF作为抗血管生成靶点的抑制剂已成为抗肿瘤治疗的方式之一。2004年，VEGF的单抗贝伐单抗(Bevacizumab)作为靶向抗血管治疗药物由FDA批准上市，随后还批准了索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)上市。可用于肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌等多种癌症的治疗[14]。 此外，通过对在婴幼儿血管瘤组织的研究发现，在增殖期、消退期等不同时期其组织内的VEGF与Notch信号和缺氧之间是相互影响和调控的[15]。在鲜红斑痣激光治疗后血管再生的机制研究中，也发现VEGF与下游PI3/K/AKT/mTOR/P70S6K和SHC1/MEK/ERK途径的级联反应是密切相关的，可以通过抑制VEGF信号来调节鲜红斑痣激光治疗后引起的血管再生[16]。另外，老年性黄斑变性、高血压、冠心病等多种疾病都与VEGF相关。

4 缺氧诱导因子(HIF)概述

HIF是对细胞缺氧进行调节的重要基因。HIF最早是1992年被发现的，HIF家族主要有HIF-1、2、3三种亚型。主要是α和β两个亚基组成, α亚基主要调节其活性；β亚基则主要负责稳定性。HIF-1α是目前已知的缺氧信号的主要调控基因。HIF-1α广泛表达于几乎所有的先天性和适应性免疫群体，HIF-2α在多种细胞类型中都有表达，如：内皮细胞和某些免疫细胞[17]。

HIF-1α通过充当氧传感器的脯氨酸羟化酶在特定脯氨酸残基上羟基化；也可通过E3/pVHL泛素连接酶而被泛素化。在常氧情况下，快速泛素化和26S蛋白酶体降解会导致HIF-1α的稳定性降低。在缺氧情况下，HIF-1α水平升高是泛素化减少和蛋白酶体介导降解减少的结果。在典型的缺氧反应中，缺氧通过改变HIF-1α的活性和稳定性而发挥作用，稳定的HIF-1α与HIF-1β(也称为ARNT)相结合，再与一些效应基因的特异性缺氧反应元件(HRE)相作用，激活其下游的血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、PAI-1、转铁蛋白和促红细胞生成素等基因，参与血管生成和葡萄糖代谢等过程[18]。典型的缺氧反应也能将缺氧信息传递并激活Notch信号通路，从而启动其下游的一系列反应。

5 HIF-VEGF-Notch信号通路在血管生成中的相互作用及其机制

在肿瘤发生发展、伤口的愈合、炎症反应等过程中，都会有血管生成的参与。血管生成也是机体防御反应的一部分，其过程涉及许多种分子机制， 而VEGF、HIF-1α以及Notch信号通路之间能通过相互调控作用共同影响血管生成。

5.1 VEGF与HIF HIF-1α作为氧浓度的关键分子，在缺氧反应中受到多水平的调节。许多研究表明，HIF-1α mRNA在啮齿动物和人类的缺氧或缺血反应中增加。此外，HIF-1α mRNA的稳定也可能有助于其自身mRNA的持续增加。在典型的缺氧反应中， HIF-1α的活性和稳定性发生改变，导致HIF-1α与特定靶基因中含有的相应调节因子结合，激活下游多种基因，发生信号级联反应。缺氧激活的HIF-1α可以转运到细胞核中，直接与下游靶基因VEGF启动子的缺氧反应元件结合并使其转录，从而导致VEGF信使RNA(mRNA)水平的增加[19]。

5.2 VEGF和DLL4/Notch信号在尖端细胞(内皮细胞)中的作用 DLL4作为Notch信号的配体之一，主要表达于内皮细胞，是血管生成的调控因子之一并具有重要作用。当血管生成发生时， DLL4主要表达于血管出芽最前端的尖端细胞，此外，在内皮细胞、茎细胞和毛细血管等也有表达。它与VEGF一起相互作用共同调控茎细胞与尖端细胞的分化、迁移和增殖等过程。血管内皮生长因子(VEGF-A)在血管生成和功能调节过程中都十分重要[20]。主要通过引导血管尖端细胞的延伸来参与血管生成[21]。

对培养的内皮细胞的研究揭示了VEGF和DLL4-Notch通路可相互作用并调节血管生成。VEGF作为DLL4上游的信号调节因子，能增加DLL4的表达。用VEGF刺激培养的内皮细胞会导致DLL4 mRNA和蛋白质的表达增加。研究表明Notch信号在VEGF-A的刺激下诱发ECs的侧向抑制，导致ECs不均匀分布。此时茎细胞受到增强的Notch信号传导，抑制VEGFR2的转录，同时刺激可溶性受体VEGFR1(sVEGFR1)的表达。而尖端细胞接收到的信号，则允许表达高VEGFR2和低sVEGFR1[13]。另外，有研究表明DLL4实际上是通过上调VEGFR1，而下调VEGFR2产生作用，其中VEGFR1的激活可以抑制血管ECs的增殖，而VEGFR2的激活则会促进血管生成[22]。即可以总结为VEGF是DLL4-Notch信号通路的正向调控基因，而DLL4-Notch信号通路对VEGF具有负反馈调控作用[23]。在内皮细胞中， DLL4/Notch信号的主要作用是抑制内皮细胞增殖、迁移和发芽。DLL4/Notch信号被阻断后会引发内皮细胞的过度增殖，尖端细胞增多，最终导致血管生成不完全和血管灌注不良等[24]。

VEGF和DLL4/Notch信号的相互调控能避免形成过多的无功能血管，并且能诱导血管形成正常且功能成熟和管腔化完整，进而使得血管系统可以根据环境的变化需求来适时形成血管，这些作用对于机体是否能形成有完整功能的血管网是必要的。当这种平衡调节被打破后，就会导致形成无功能的血管、血管渗漏或者血管生成过度。

5.3 HIF-VEGF-DLL4信号的相互调控 VEGF是一个典型的缺氧反应基因，且能与HIF基因相互作用，促进彼此的表达。在缺氧区，HIF-1α在ECs中上调，导致VEGF-A分泌增强。VEGF-A刺激内皮细胞表达Notch配体DLL4。另外，缺氧时可诱导HIF-1α与Notch互相作用。此时Notch前体在没有活性的状态下被类似于Furin转化酶水解并转移到细胞中，与Notch配体结合，通过一系列的酶解反应激活NICD。当NICD激活后，CSL成为一个转录激活因子来进一步激活下游基因，使其开始转录。在NICD没有活化的情况下，CSL转录因子抑制Notch靶基因的转录。缺氧时产生的HIF-1α也可通过直接影响NICD的活性来增强Notch信号的表达[13]。

由缺氧引起的NICD激活，是通过缺氧对NICD稳定性的调节和 NICD-CSL相互作用完成的，而不是由HIF-1α与其DNA的直接作用。HIF-1α是一个高度Notch特异性启动子，包含CSL结合位点，能在缺氧条件下被强烈激活[18]。

总之，在缺氧的情况下，经过VEGF的诱导，DLL4的激活可以间接发生。而且缺氧可引起DLL4表达直接上调，HIF-1α通过与DLL4启动子中的缺氧反应元件和相结合而产生作用，来增加机体组织对缺氧的反应[25]。此外，已有研究表明，DLL4是一个缺氧调节因子，它不仅在ECs中接收HIF-1a信号，而且能通过缺氧途径对HIF-1a-VEGF信号作出反应[26，27]。

5.4 Jagged-Notch信号通路与血管生成 目前有研究结果表明，DLL4与Jagged1对血管出芽的调控作用是相反的。DLL4在毛细血管和动脉的内皮细胞中表达，而Jagged1在内皮细胞和血管平滑肌细胞(vSMCs)中均表达。由于DLL4通过Notch1信号传导阻断内皮细胞活化，同时也诱导Jagged1的表达。然后Jagged1通过Notch1阻断DLL4信号，通过血管内皮生长因子激活内皮细胞[28]。研究发现内皮细胞Jagged1的过度表达提高了真皮伤口的愈合率，并与新生血管的密度、成熟度和功能性增加有关，而内皮细胞特异性Jagged1基因敲除产生的作用则相反。除拮抗DLL4导致的Notch信号激活外，Jagged1还可以通过直接向tip细胞发送信号调节VEGF受体3(VEGFR3)的表达来促进血管生成。VEGFR3在介导淋巴管生长中起着重要作用，但它也在促进血管生成的内皮尖端细胞中表达[29]。因此，我们可以设想，正如DLL4-Notch信号转导下调茎细胞VEGF受体的表达以抑制血管生长一样，Jagged1-Notch信号可转导尖端细胞VEGFR3的表达以促进血管生长。Jagged在Stalk细胞中高表达，而DLL4则主要在Tip细胞中表达，糖基转移酶Fringe可以介导Jagged1和DLL4在内皮细胞中的相互拮抗作用，Fringe能以配体依赖的方式调控Notch受体的翻译后修饰。因此，Jagged1不但可以抵消内皮细胞中的DLL4/Notch信号，还可以维持血管发育成熟等过程，使二者相互协调，相互平衡。

5.5 血管生成在皮肤科疾病中的作用 血管生成在多种皮肤病中都起着重要作用，在慢性炎症性皮肤病，如银屑病和特应性皮炎中都存在血管生成改变。此外，像荨麻疹、紫外线引起的损害和血管性水肿等急性炎症性皮肤疾病也与血管生成因子的变化有关。在系统性硬化症中，也存在促血管生成因子到抑制血管生成因子的转换，这一转换在该疾病的血管缺陷过程中发挥作用[30]。

其中一些皮肤科与血管生成相关的疾病也与HIF-VEGF-Notch信号相关。

血管瘤是婴幼儿时期的一种良性血管肿瘤，血管生成被认为是其发病机制之一。通过血管瘤患者组织以及血管瘤干细胞(HemSCs)和血管瘤内皮细胞(HemECs)的研究发现，人血管瘤内皮细胞中VEGF-A和HIF-1α的表达显著高于正常内皮细胞，近年来发现普萘洛尔治疗血管瘤的机制之一就是通过抑制HIF-1α、VEGF-A的表达发挥作用[31]。还证明Notch3信号的异常表达使得HemSCs衍生的壁细胞在血管瘤中异常分化并导致血管病变[32]。此外，与正常组织对比， Notch1、Notch4及Jagged1在血管瘤组织中表达增高[33]。

银屑病的发生与慢性炎症相关，而血管生成在银屑病的发病机制中起着重要的作用，也是最早发现的炎症组织学特征之一。通过对银屑病患者皮损组织研究发现银屑病皮损区与非皮损区相比，Notch1、DLL4和Hrt1表达升高，以血管区表达最高。并且观察到的Notch配体的差异可能与EC层、炎症微环境、与VEGF的相互作用以及血管的成熟度有关。此外，Jagged1可介导免疫细胞的募集，使其浸润到皮肤的表皮和真皮血管区域；Notch1已被证明在炎症性关节炎中介导TNF-α诱导的滑膜细胞增殖。提示Notch在促进滑膜增殖和邻近软骨的侵袭中发挥作用[34，35]。这进一步支持Notch调节机制在银屑病增生侵袭表皮层的作用，说明Notch配体-受体通路可能调控血管功能障碍和参与银屑病发病机制的促炎机制，提示靶向阻断该通路可能有重要的治疗意义。

为了使癌细胞具有高增殖率，肿瘤需要迅速形成新的血管网。表明血管生成参与肿瘤发生发展过程。Notch信号通路的异常表达，可能通过影响肿瘤中的血管生成，导致其过度形成功能不成熟的异常血管，增加肿瘤的转移扩散。在皮肤肿瘤中，异常的Notch信号可导致皮肤癌的发展，如鳞状细胞癌、基底细胞癌和恶性黑素瘤。人基底细胞癌中Notch1、Notch2、Jagged1表达降低，提示表皮中Notch信号的缺失可能导致基底细胞癌的发生。这表明Notch信号的靶向抑制剂可能可以通过抑制血管生成来抑制肿瘤的发生发展[36]。

6 结论

血管生成在众多疾病及生理过程中都扮演着重要的作用。HIF-VEGF-Notch信号通路在血管生成中的相互作用对血管生成过程有着重要的影响。明确它们之间的关系，可以通过调控其中的某个因子或通路而抑制或促进血管生成。而且这些信号因子及通路在抗肿瘤药物研发、心脑血管疾病缺血后的血管再生、组织修复及免疫炎症后导致的血管生成等诸多方面是一个热点研究方向。如何将它们更加准确和更好的应用，并发挥其在血管生成方面的优势也将是未来研究的方向。