外泌体miRNA在脑卒中的作用机制研究进展

王光华，王桂斌，滕晓华

脑卒中患者具有高致死、致残率及较高的发病率，因此预防和治疗十分重要[1]。外泌体运输至靶细胞后激活靶基因，通过修复神经血管单元、抗炎、抗氧化应激和抗凋亡等治疗脑卒中[2-3]。如来源于外泌体miRNA-124的小胶质细胞和来源于外泌体miRNA-126的内皮细胞参与调控小胶质细胞极化的平衡并发挥抗炎作用。细胞分泌的外泌体为内容物复杂的直径30～100 nm膜脂结构，包裹和运输蛋白质及核酸，包括miRNA。没有外泌体脂质膜包裹的裸露miRNA在血液循环内数小时会被核糖核酸酶迅速降解，而包裹在外泌体中的miRNAs经血液循环远距离传递至靶细胞发挥作用。深入研究发现，miRNA除在外泌体治疗脑卒中时发挥重要作用，同时在脑卒中的诊断和预后评估中起关键作用。现对多种外泌体miRNA在脑卒中的作用分子机制作一简要综述。

1 不同细胞来源外泌体对脑卒中的治疗作用

越来越多的研究发现，不同细胞来源的外泌体在治疗脑卒中时发挥着重要作用。如体内研究表明，脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）来源的外泌体促进M2型小胶质细胞极化，显著减少脑卒中梗死面积；体外研究表明，抑制自噬显著降低缺氧诱导的炎症反应，外泌体通过逆转缺氧诱导的炎症反应而更有效地抑制小胶质细胞极化至M1型[4]。研究发现，在大鼠短暂性大脑中动脉栓塞后立即注射M2小胶质细胞来源外泌体后，M1小胶质细胞减少，M2小胶质细胞增多，M2小胶质细胞来源外泌体治疗组IL-1、肿瘤坏死因子-α表达低于对照组，IL-10和转化生长因子-β表达高于对照组，提示M2小胶质细胞来源外泌体治疗可抑制短暂性大脑中动脉栓塞后的炎症反应[5]。研究发现T2型糖尿病大鼠脑卒中后给予内皮细胞来源外泌体治疗可增加T2型糖尿病卒中大鼠脑缺血区域血管密度、轴突和髓鞘密度，提示内皮细胞来源外泌体促进血管生成和轴突重塑[6]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源外泌体穿过血脑屏障对脑卒中发挥治疗作用，运送内容物至靶细胞调节靶基因。

2 外泌体miRNA对脑卒中的作用

研究表明，外泌体治疗脑卒中具有显著疗效，外泌体内容物具有复杂性和差异性等特点，miRNA是外泌体主要内容物之一。miRNAs参与细胞增殖、炎症、氧化应激和凋亡等生理过程，同时一个miRNA可以靶向多个基因，一个基因被多个miRNA靶向作用[7-8]。外泌体将所含miRNAs转移至受体细胞达到治疗目的。如MSC来源的外泌体miRNA-17-92和miRNA-133b促进缺血性卒中后轴突重塑和功能恢复[9-10]。神经元来源外泌体miR-132已被报道为介导神经血管通讯的细胞间信号[11]。最近的一项研究表明，创伤性脑损伤后小胶质细胞来源外泌体miRNA-124增加，通过将miRNA-124转移到神经元中，抑制神经元炎症，促进轴突生长[12]。外泌体miRNA对脑卒中起治疗作用的有miRNA-124、miRNA-126、miRNA-145、miRNA-30d-5p、miRNA-133b及miRNA-17-92,起诊断作用的有miRNA-30a-5p及miRNA-98-3p等，起预后评估作用的有miRNA-134等。

2.1 外泌体miRNAs对脑卒中的治疗作用

2.1.1 miRNA-126脑卒中死亡的主要原因是心血管疾病和脑损伤[13]。研究结果显示，与外泌体miRNA-126治疗脑卒中大鼠相比，miRNA-126基因敲除大鼠在脑卒中后心功能显著降低，心肌肥大、纤维化和细胞炎症因子表达增加，提示miRNA-126表达降低可能是大鼠脑卒中后心功能不全的原因之一[14]。另一项研究发现与非糖尿病脑卒中大鼠相比，T2型糖尿病脑卒中大鼠血浆和脑中miRNA-126水平降低，内皮细胞来源外泌体miRNA-126治疗T2型糖尿病脑卒中小鼠后，血管密度、动脉管径、内分水岭脑梗死区域的轴突和髓鞘密度增加，并诱导M2巨噬细胞极化，进而改善神经功能，而抑制内皮细胞来源外泌体miRNA-126可显著减弱内皮细胞来源外泌体诱导的毛细血管形成和轴突生长[6]。提示内皮细胞来源外泌体miRNA-126能调控血管和轴突生长，从而修复T2型糖尿病大鼠脑卒中损伤。

2.1.2 miRNA-145糖尿病患者伴随着血管通透性的增加导致脑卒中的高发病率[15]，在糖尿病脑卒中大鼠中发现严重的白质病变和轴突损伤[16-17]。在体外，与来自正常大鼠的骨髓间充质干细胞（normal bone mesenchymal stem cells，NOR-BMSCs）组相比，来自糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞（diabetes mouses-bone mesenchymal stem cells，DM-BMSCs）组的miRNA-145表达降低[18]。在体内，DM-BMSC治疗显著改善血管和神经元白质重建，降低血清miRNA-145的表达，并增加miRNA-145靶点三磷酸腺苷结合盒转运体1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）和胰岛 素样生 长 因子1受 体（insulin-like growth fastor-1 receptor，IGF-1R）的表达，与NOR-BMSC治疗相比，DM-BMSC治疗卒中降低缺血边缘区miRNA-145的表达，增加ABCA1和IGF-1R的表达，而miRNA-145+/DM-BMSCs显著增加T1 DM-MCAO大鼠血清miRNA-145的表达，降低脑ABCA1和IGF-1R的表达，减弱DM-BMSC诱导的神经修复作用[18]。上述结果提示miRNA-145/ABCA1/IGF-1R通路可能参与T1糖尿病卒中大鼠神经修复作用。

2.1.3 miRNA-30d-5p脑卒中通常会引起神经细胞的缺血缺氧，促进神经炎症反应，进而损害神经组织[19]。研究证明脑卒中后的炎症反应在脑组织微环境的改变中起着重要作用[20]。大脑M2/M1小胶质细胞比值的增加具有抗炎特性，并提供神经保护作用。IL-4和IL-10是M2小胶质细胞分泌的标志物，而肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6和诱导型一氧化氮合酶是M1小胶质细胞分泌的标志物，在脑卒中患者和动物模型中注射ADSCs来源外泌体miRNA-30d-5p，TNF-α、IL-6和诱导型一氧化氮合酶的表达降低，而抗炎细胞因子IL-4和IL-10的表达增加。提示ADSC来源的外泌体miR-30d-5p通过抑制M1型小胶质细胞极化来预防脑损伤和抑制炎症反应来减少缺血诱导的脑损伤[21]。

2.1.4 miRNA-133b Xin等[22]首次在大鼠脑卒中后全身注射MSC来源外泌体，与对照组相比，全身注射MSC来源外泌体显著促进脑卒中大鼠的功能恢复，脑皮质和纹状体缺血边缘区突触素免疫阳性面积和轴突密度较对照组明显增加。Xin等[23]深入研究发现MSC来源外泌体miRNA-133b能增强神经可塑性和促进功能恢复，通过注射过表达miRNA-133b的MSC来源外泌体较单纯MSC处理后，缺血边界区特异性miRNA-133b靶点，如结缔组织生长因子和Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）的表达明显降低，反之静脉注射低表达miRNA-133b的MSC来源外泌体导致脑卒中大鼠轴突重塑和神经功能减弱。在体外，皮层神经元与miRNA-133b过表达的外泌体孵育可下调RhoA表达水平并促进轴突生长，miRNA-133b过表达的外泌体处理星形胶质细胞则抑制结缔组织生长因子的表达[22-23]。这些数据表明MSC来源外泌体miRNA-133b能够调控RhoA基因表达，改善脑卒中大鼠神经元轴突重塑和神经功能恢复。

2.1.5 miRNA-124 miRNA-124在M2型小 胶质 细胞BV2来源外泌体（M2-EXO）中表达增加。M2-EXO被神经元摄取并进一步提高神经元存活率，这一过程是由外泌体miRNA-124及其靶基因USP14介导。体外研究发现在培养神经元时加入外泌体45 s后开始摄取M2-EXO。体内研究表明，外泌体能够穿越血脑屏障。在短暂大脑中动脉缺血后立即注射，第3天在大脑中检测到的外泌体很少，并且每个区域的外泌体都不同[5]。然而，经M2型小胶质细胞来源外泌体miR-124治疗后，可抑制泛素特异肽酶14（ubiquitin specific protease 14，USP14）的表达，抑制USP14可增强蛋白酶体活性，减少体外氧化应激诱导的细胞死亡[24]。提示miRNA-124通过靶向脑缺血后的USP14发挥神经保护作用。提示外泌体miRNA-124通过靶向抑制脑缺血后的USP14表达和氧化应激起到神经修复作用。

2.1.6 miRNA-17-92体外研究表明miRNA-17-92过表达的MSC外泌体与对照组MSC外泌体相比，磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）蛋白表达水平增加促进胚胎皮质神经元的轴突生长，但研究中没有观察到外泌体诱导的血管生成。体内研究采用大鼠大脑中动脉闭塞模型，静脉注射miRNA-17-92过表达的MSC外泌体，与对照组MSC外泌体相比，miRNA-17-92过表达的MSC外泌体增强神经恢复，包括少突胶质形成和轴突可塑性[25]。提示与单纯的外泌体相比，过表达miRNA-17-92引起的外泌体含量变化可能有助于卒中后神经可塑性的增强和神经功能恢复，可能是通过影响靶细胞来实现。miRNA-17-92调控PTEN表达及其下游信号通路，影响蛋白激酶B、雷帕霉素蛋白和糖原合成酶激酶3β的磷酸化，可能是高表达miRNA-17-92的外泌体治疗脑卒中的差异化疗效的基础。研究证明，在卒中后24 h开始治疗，MSC和MSC外泌体治疗不会改变脑梗死面积，但不能排除在卒中后24 h使用富含miRNA-17-92的MSC外泌体治疗在缺血边界区域也能起到保护神经的可能性[25]。提示外泌体miRNA-17-92可能通过PTEN通路介导神经修复。

2.2 miRNAs在脑卒中的诊断作用

2.2.1 miRNA-30a-5p研究证实急性缺血性脑卒中患者血浆来源外泌体miRNA-30a-5p的表达水平在24 h、1周、4周、24周和48周均低于对照组，提示血浆来源外泌体miRNA-30a-5p的表达水平在急性脑缺血性卒中患者中显著下降，但在6 h内显著上调[26]。上述结果提示血浆外泌体miRNA-30a-5p可能对急性脑缺血性卒中有诊断价值。

2.2.2 miRNA-98-3p人源神经干细胞（human neural stem cells，hNSC）外泌体中的部分miRNAs与其细胞来源的外泌体不同，它们可能受到缺血环境变化的影响。从hNSCs中提取外泌体，并利用NGS分析hNSC来源的外泌体miRNA的表达谱，结果表明，在hNSC来源外泌体中检测到差异表达的miRNAs，并且参与hNSC的外泌体对缺血免疫微环境有反应，miRNA-98-3p被认为是一种特殊的hNSC来源的外泌体miRNA，在脑卒中动物模型中表达水平显著下调[27]。提示外泌体miRNA-98-3p可能具有诊断脑卒中的作用。

2.3 mi-RNA在脑卒中的预后评估作用

2.3.1 miRNA-134体内研究发现，在脑卒中大鼠模型中miRNA-134的表达水平上调，缺血性卒中后轴突可塑性减弱[28]，体外研究还发现，miRNA-134的过表达显著促进缺血缺氧-葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经元死亡[29]。收集急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者和正常对照组的血样，从血样中分离出外泌体，RT-qPCR分析显示，急性缺血性脑卒中患者发病后24 h内，血浆来源外泌体miRNA-134的表达高于对照组，但是卒中后24、48、72 h血浆来源外泌体miRNA-134水平差异无统计学意义（P＞0.05），外泌体miRNA-134的表达变化与相对较早的时间段的关系有必要作进一步的研究，高表达的血浆来源外泌体miRNA-134与NIHSS评分、梗死体积呈正相关，并与脑卒中患者的不良预后呈正相关，此外，miRNA-134与血清IL-6和血浆高敏C反应蛋白的表达呈显著正相关，ROC曲线提示miRNA-134可能是区分AIS患者和非卒中对照的一个潜在因素[30]。提示外泌体miRNA-134具有评估脑卒中预后的作用。

3 总结与展望

虽然外泌体治疗脑卒中相关研究很多，但目前众多问题仍待解决：①少数miRNAs在外泌体中的水平与来源细胞的关系。事实上，大约30%外泌体miRNAs与来源细胞中的miRNAs构成不成比例，这表明miRNA不是随机分布的，特定的miRNA被选择运输到特定微环境[31]。②miRNAs是如何特异性地装载到由来源细胞释放的外泌体中。研究表明，将神经元特异性狂犬病病毒糖蛋白肽融合到MSC来源的外泌体，结果显示比未修饰的外泌体进一步促进神经功能恢复。③外泌体注射的时间窗和组织窗。在大脑中动脉缺血性脑卒中后立即注射M2型巨噬细胞来源外泌体miRNA可以减轻缺血再灌注损伤，但在卒中后不同时间窗注射疗效差异明显，并且缺血边缘区的外泌体miRNA的表达水平与缺血核心区有差异。④当前外泌体miRNA治疗脑卒中的研究以实验动物居多，临床应用较少，动物实验结果与临床实践的差异性不容忽视。最后，外泌体miRNA在脑卒中的作用分子机制仍需更多深入研究，以期早日安全应用。