基于网络药理学与GEO差异基因芯片数据分析复方苦参注射液治疗宫颈癌的机理和分子靶点

包君丽,高欣元,韩宇博,林海燕,彭坤明,郑义

宫颈癌是仅次于乳腺癌的一种常见的妇科肿瘤疾病[1]。研究显示造成宫颈癌病变的主因是高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染[2-3]。目前宫颈癌的主要治疗方案是手术和放化疗治疗，但疗效有限，易复发。新型免疫治疗，如抗体靶向治疗和过继细胞治疗的疗效也不理想[4-5]。

古代中医医籍虽没有与宫颈癌同名病例，但依据其临床症状可将其归属于“崩漏”、“五色带下”、“癥瘕”等范畴，该范畴之内中医具有丰富的治疗案例[6]。近些年来中医药在宫颈癌的治疗过程中取得了不错的进展[7]。大量的临床研究表明复方苦参注射液治疗宫颈癌疗效尤为显著[8-9]。中药研究发现苦参、白土苓具有凉血解毒、抗癌、提高免疫力等功效，苦参和土茯苓的中药制剂已被中国中医药管理局批准用于临床辅助治疗各种癌症[10-12]。目前复方苦参注射液治疗宫颈癌的研究主要以临床为主，对其药理研究相对较少，其作用于宫颈癌机制的相关动物实验和细胞实验更少。

本研究利用网络药理学和分子对接的方法研究复方苦参注射液治疗宫颈癌中化合物、作用靶标和作用机制。

1 资料及方法

1.1 复方苦参注射液化合物与相应靶标的收集

通过中药系统药理学数据库平台(TCMSP）[13]、中医药综合数据库(TCMID)[14]和中医药整合药理学研究平台(TCMIP）[15]，以复方苦参注射液全方药物“苦参”、“土茯苓”为关键词在“Herb name”条目中检索其化合物，根据药物化合物ADME的分子动力参数，将药物筛选阈值设定为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，获得复方苦参注射液的有效化合物分子，同时在平台获得其对应的候选靶标。

1.2 宫颈癌GEO芯片热图与火山图绘制从GEO数据库[16]获取GSE63514芯片与相关数据，使用R软件，设定P＜0.005 and|log2(fold change)|＞1，制作火山图与热图，收集疾病的差异基因。

1.3 靶蛋白互相作用网络图构建将复方苦参注射液与宫颈癌的差异基因取交集后,检索String数据库[17]，获得蛋白互作关系，以“TSV”格式导出结果。通过Cytoscape3.7.2软件对蛋白互作关系进行可视化处理，NetworkAnalysis实施网络拓扑分析，分别以每个节点为中心计算相应的Degree值(连接度)，图示化相互作用关系网络(protein protein interaction,PPI)，并以PNG格式导出。

1.4 化合物-作用靶标网络构建与分析去除重复及与化合物没有交集的靶点，将与治疗宫颈癌潜在作用靶点相对应的化合物分子构建关系数据表作为Cytoscape3.7.2软件输入的源文件，图示化展现药物活性成分与作用宫颈癌靶标之间的相互关系。

1.5 生物学过程及通路分析通过bioconductor里所包含的clusterprofiler程序包去富集分析复方苦参注射液作用于宫颈癌的靶标基因，设置P≤0.05，再通过pathview对所获得的分子功能(molecular functions，MF)、生物过程(biologicalprocess，BP)、细胞组分(cellular components,CC)、及KEGG通路数据进行可视化，绘制与之对应的前30条数据的高级气泡图。

1.6 分子对接在PDB蛋白质数据库[18]获取复方苦参注射液重要化合物结合的候选蛋白质的晶体结构，利用MOE插件structure prepare进行修饰，去除配体、添加氢、去除水、优化和修补氨基酸，最小化所有候选靶点的能量。

2 结果

2.1 复方苦参注射液化合物及靶标筛选收集苦参和土茯苓化合物共178个，对应的靶标共1 136个。

2.2 宫颈癌GEO芯片热图与火山图绘制获取的128个样本，运用R软件来制作火山图与热图，再利用excel汇总疾病的差异基因。红色代表相应基因表达上调，绿色代表相应基因表达下调，颜色越深则表示基因表达的差异性越大，图1,图2。复方苦参注射液靶标基因与宫颈癌GEO差异基因的交集基因共118个，为复方苦参注射液对宫颈癌的潜在作用靶标。

图1 正常人与宫颈癌患者差异基因热图

图2 正常人与宫颈癌患者差异基因火山图

2.3 靶蛋白互作网络图图3中共包括112个节点，1 396条边，节点尺寸越大，颜色越深表示相应节点的Degree越大，通过靶蛋白互作网络图计算得出相关节点度数的平均值为13，根据中值原则选取degree＞13的靶点（共计41个）作为重点研究，如VEGFA、MAPK3、CDK1、CCND1、MMP9、CDK4、CCNB1、CCNA2、HRAS、CXCL8、CHEK1、TOP2等。

图3 靶蛋白互作网络图

2.4 药物-化合物网络构建将复方苦参注射液化合物和与宫颈癌的作用靶标绘制成药物-化合物-靶点-疾病网络图。图中节点共计296个，其中化合物分子178个，潜在作用靶点118个，边线共计1 143条。复方苦参注射液主要通过多成分对应多靶标来发挥对宫颈癌治疗作用，图4。

图4 药物-化合物-靶点-疾病网络图

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析结果显示，BP分析富集基因数量较大的有不饱和脂肪酸代谢过程(unsaturated fatty acid metabolic process),对酸性化学物质的反应(response to acid chemical),胶原分解代谢过程(collagen catabolic process)等，点越大富集基因越多，P值越小颜色越红，则表示相应结果的置信度越高，图5。KEGG通路富集结果共计有共135条通路(P＜0.05)，如细胞周期信号通路(Cell cycle)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎信号通路(Hepatitis B)等，通路节点越大，表示富集该通路基因数量越多，颜色越深则表示P值越小，图6。

图5 BP分析

图6 KEGG富集图

2.6 分子对接测试苦参碱和以下潜在靶蛋白（图7）:CDK1（PDB:6gu2）、MMP9（PDB:6esm）之间的对接精度。苦参碱是复方苦参注射液的主要化合物之一，目前有大量的关于苦参碱治疗宫颈癌的研究[19-21]。这些靶蛋白在PPI网络图中处于关键位置，同时它们参与了关键通路，提示它们宫颈癌对化合物的反应中可能起关键作用。对接分析结果显示靶标蛋白和化合物分子之间结合性不错。

图7 苦参碱(MOL005944)与CDK1、MMP9的分子对接

3 讨论

本研究结果表明，复方苦参注射液的有效活性化合物分子共有178个，其治疗宫颈癌的靶标蛋白有118个，利用R软件对这些靶标蛋白进一步分析获得复方苦参注射液治疗宫颈癌的生物过程及富集通路，从而探究复方苦参注射液对宫颈癌治疗作用机制，为其治疗宫颈癌提供理论依据，更加科学的指导临床应用，也为进一步的实验探究提供方向。

已有临床数据验证复方苦参注射液中的主要活性成分苦参碱对宫颈癌治疗有显著疗效。其中程熠[22]等的体外实验表明苦参碱可能通过诱导细胞凋亡、阻断细胞周期进程来抑制宫颈癌HeLa细胞增殖。之前的很多研究结果表明苦参碱抑制宫颈癌SiHa细胞的活力和迁移能力[23-25]。王芳[26]报道苦参碱对宫颈癌C33A细胞增殖具有抑制作用并可以诱导其凋亡。王英[27]等的小鼠实验结果表明苦参碱能增强顺铂抑制U14细胞增殖作用。李军[28]等的实验结果提示苦参碱通过抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖，可以使癌细胞周期滞留在G0/G1，S期细胞数减少。此外，大量的研究表明苦参碱通过抗炎、抗菌、抗病毒等作用发挥其对宫颈癌发生发展的预防作用。

根据“靶蛋白互作网络图”以及文献资料分析可得，复方苦参注射液可能通过作用血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)等4个靶标对宫颈癌发挥治疗作用。VEGFA是由VEGFA基因编码的蛋白质，对内皮细胞发挥作用，可增加血管通透性，诱导血管生成，血管发生和内皮细胞生长，促进细胞迁移和抑制细胞凋亡。Ioana[29]等的临床实验发现宫颈癌手术后复发的患者血清VEGFA显著升高，提示VEGFA与宫颈癌发病密切相关，同时可预测宫颈癌放疗效果。CDK是细胞周期调控的核心物质，CDK1是CDK的一种，其在分裂间期活性高，分裂期活性迅速下降，以顺利完成分裂。Deng[30]等的Sp1可能通过靶向CDK1抑制G2/M期阻滞而参与宫颈癌放疗治疗，提示Sp1、CDK1有望成为提高宫颈癌放疗疗效的潜在治疗靶点。大量的研究表明CCND1和肿瘤发生发展关系密切，其机制是CCND1基因末端的polyA尾的过度表达会导致细胞G1期缩短，进而体积缩小，分裂原的依赖性减弱，促进细胞周期与细胞增殖。Akin[31]等的细胞实验结果表明依维莫司、吉西他滨和紫杉醇可降低宫颈癌CCND1的表达，提示CCND1是宫颈癌治疗的关键靶点。MMP-9可降解细胞外基质,在肿瘤细胞生长,分化,侵袭,转移，调节肿瘤血管生成及免疫监视中起到重要作用，与多种肿瘤的发生和发展密切相关。张瑞敏[32]等的临床观察结果表明宫颈癌患者血清MMP9水平均明显升高,且与患者的临床分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移情况有关。

文献检索结合KEGG通路富集分析表明,复方苦参注射液治疗宫颈癌主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)，P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK),核转录因子(NF-kappa B)，低氧诱导因子-1(HIF-1)。陆蓉[33]等的动物实验提示苦参碱可能是通过抑制PI3K/AKT信号转导通路来抑制HeLa细胞在机体内生长达到治疗作用。王博[34]等的细胞实验发现汉黄岑素可以通过调节P53信号通路增强宫颈癌细胞的自噬和凋亡，抑制其增殖,实现增强宫颈癌对顺铂的化疗敏感性，且在一定剂量范围内呈剂量依赖性。洪丹丹[35]等的细胞实验结果验证了小檗碱可以通过对TLR4-NF-κB信号通路调控来影响Bcl-2的表达,对于宫颈癌Hela细胞的增殖和迁移，促进其凋亡具有显著的抑制作用，证明了小檗碱对治疗宫颈癌有一定的作用。

4 小结

总之，本研究发现复方苦参注射液治疗宫颈癌的主要化合物有苦参碱、槐定碱、右旋异苦参碱、赝靛叶碱、苦参醇、降苦参醇等，这些化合物通过作用于OPN、MMP-9、SIRT1、VEGFR-3等靶标以及调节PI3K-Akt、apelin/APJ、P38MAPK、NF-kB、AMPK等信号通路发挥对宫颈癌的治疗作用。这表明复方苦参注射液治疗宫颈癌具有多成分、多靶点、多通路参与的特点。本研究的不足之处在于未能通过科学实验证实其他治疗宫颈癌的可能机制，但可以为有关实验的深一步进行提供思路与方向。