小型猪作为耳科新型动物模型在中国的建立与应用

伊海金

耳科学是以研究听觉与平衡系的重要学科，其常见疾病为耳聋与眩晕，我国目前有耳聋患者2 700万人，其中聋哑人200多万，并以每年3万多的数量在增长；眩晕更是临床常见的症状，眩晕的患病率为0.5%,约占内科门诊的5%、耳鼻咽喉科门诊15%，70岁以上的男性及女性老人眩晕的发病率分别达47%和61%。耳聋及眩晕给个人、家庭及社会带来巨大的痛苦和沉重负担，加强耳科学的基础与临床研究，尤其是拓展耳聋及眩晕基础研究，创新耳聋与眩晕的治疗技术是解决上述问题的关键所在。医学创新研究往往需要动物实验验证,动物模型在生物医学研究中占有重要地位。因此，寻找合适的动物模型至关重要。

动物模型指用于生物医学领域的实验动物，以进行相关疾病及其他科学问题研究，目前啮齿类动物应用最为广泛。啮齿类动物模型存在的主要问题是与人亲缘关系较远，其遗传、体型以及寿命与人类存在较大差异[1]，限制了在人类疾病、药物开发以及治疗方面的应用。非人类灵长类动物与人类亲缘关系近，但存在伦理问题，并且应用费用昂贵、技术复杂、资源匮乏[1]。大量研究表明，猪与人的氨基酸同源性达84.1%，在解剖结果、生理代谢以及疾病发生机理上与人有很多相似之处[2]，目前在动物实验领域应用日趋广泛。

1 猪及小型猪动物模型在医学及耳科学领域的应用概述

以猪作为人类疾病动物模型的研究目前主要包括循环系统疾病、器官移植、神经系统疾病、糖尿病、皮肤病、遗传性疾病及肿瘤等领域，对于开展医学基础研究及创新临床新技术应用发挥重要作用[3-4]。尤其是自1949年明尼苏达州小型猪在Hormel研究所应用以来[5]，因其体型较小，操作方便，具有与人类在基因、解剖和生理上的相似性以及经济学、伦理学方面的优势，小型猪作为大型动物模型已经广泛应用于生物医学研究领域[6]。

在耳科学领域，新西兰兔、豚鼠、沙鼠等小型哺乳动物都是传统的耳科实验动物模型[7-10]，其中常用动物模型是啮齿类动物，因其体型及内耳体积较小，发育成熟晚，解剖结构与人类差异较大，阻碍了此类动物模型在耳科领域的进一步应用。由于猪与人类存在诸多相似性，诸多学者开始初步探索猪在耳科动物实验中的应用。Ikarashi等[11-12]以猪为模型进行了中耳炎与乳突气化之间相关性研究，也有部分学者应用猪模拟人类中耳手术进行中耳手术教学训练[13-14]。此外，还有学者对猪听觉功能的初步研究，Hansen等人[15]在1992年研究高胆红素血症对新生仔猪听觉诱发电位的影响，在实验过程中清晰的记录到新生猪仔听觉脑干反应。与在其他医学领域广泛应用相比，猪在耳科动物实验领域的应用并没有形成体系，而且应用对象仅限于家猪，在世界范围内没有应用小型猪耳科动物模型的报道。

2 小型猪耳科动物模型在中国的建立及应用

国内关于小型猪在耳科领域内的应用主要集中在中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科杨仕明、郭维维团队，该团队通过创新研究，在国际上率先提出并证明了小型猪是耳科疾病研究最为理想的实验动物，并系统应用小型猪开展耳聋及眩晕发病机制、新型治疗技术实验研究，为耳聋及眩晕基础研究开创新领域。

2.1 小型猪耳部形态学、发育学、听力学和前庭功能及电生理研究为小型猪耳科动物模型建立奠定基础

2.1.1 小型猪颞骨及耳部显微解剖 通过对小型猪颞骨及耳部进行显微解剖研究，目前已证实小型猪颞骨结构中的中耳、内耳、面听神经及外侧隐窝和人类耳部具有高度相似性。通过对小型猪的外耳、中耳、内耳及外侧隐窝的形态观察和数据测量发现[16-17]：小型猪的中耳包括鼓室6壁，其上壁、外壁、内壁、前壁与人类似，下壁为乳突，后壁为半规管，与人类不同，鼓室内听骨、面神经及其分支的位置、毗邻均类似人类；小型猪耳蜗为3转半，除此不同之处以外，其耳蜗、前庭及半规管的形态、位置均与人类相似；小型猪的脑干耳蜗核的形态、结构及毗邻，包括外侧隐窝、脉络丛及听面束等神经的形态、位置及毗邻与人类类似，其Luschka孔位于绒球、二腹叶和舌咽神经根部围成的三角形内[16-17]。另外，侯昭晖等[18]通过对小型猪咽鼓管的研究也证实小型猪是咽鼓管研究的理想动物模型。

2.1.2 小型猪内耳形态及发育猪耳蜗感觉上皮的分化首先从底圈开始，再到蜗管中部，然后逐渐向顶圈进行，这与人类耳蜗发育及功能的建立具有相似性[19]。通过形态学研究发现：耳蜗螺旋器和螺旋神经节的结构与人类相似，猪的螺旋器包含毛细胞、柱细胞、Deiters'细胞、Hensen's细胞、Böttcher细胞（人类除外）和内外沟细胞。另外，猪耳蜗具有与人类相似的4排毛细胞的排列方式，不同之处在于顶回毛细胞的静纤毛呈束状排列且较长；其前庭毛细胞呈树枝状排列，并且有耳石覆盖[20]。以上研究证实，小型猪内耳的发育与形态学与人类极其类似。

2.1.3 小型猪听觉与前庭电生理在对小型猪形态学研究的基础之上，通过研究小型猪听阈及敏感听力范围发现：小型猪与人类听性脑干电位的特性比较发现猪都可以分化出7个波，但猪以Ⅱ波和Ⅴ波最显著，人以Ⅴ波最显著，其ABR波形、潜伏期与人极为相似[21-22]，啮齿类的动物只能分化出Ⅰ～Ⅴ波，说明在整个听觉传导通路上，猪与人有相似的神经核团，而鼠有所缺失。同时对小型猪的耳蜗内电位进行测试，为今后以小型猪为模型进行耳科疾病的外科治疗实验及电生理测试奠定基础。另外对前庭系统也进行系统研究[23-24]，探索小型猪肌源性诱发前庭电位的最佳检测方法，并得出结论，小型猪颈部伸肌和咬肌在强声下诱发的肌源性电位潜伏期和阈值均一致，其咬肌位置表浅，便于定位，更易于肌源性诱发电位的记录。以上研究为通过小型猪开展前庭疾病研究奠定基础。

2.2 以小型猪为动物模型开展各种耳聋模型及耳聋机制研究通过小型猪形态及内耳研究，成功构建了新型耳科动物模型，以此动物模型为基础，进一步构建不同类型耳聋模型并进行耳聋与眩晕的基础研究。如通过噪声暴露方法、乙基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）化学诱变方法和基因编辑技术构建了小型猪噪声性聋、Mondini畸形、单侧聋、MITF基因突变、大前庭水管综合征等一系列小型猪模型，为研究噪声性耳聋及遗传性耳聋发病机制奠定了基础[25]。

2.2.1 噪音性聋应用脉冲式火花噪声仪对正常小型猪进行噪声暴露，首次成功的建立了小型猪噪声性聋动物模型，分析噪声性聋小型猪听功能及内耳形态的特点，填补了大型哺乳动物噪声性聋动物模型的空白。在此基础之上，尝试应用mPEG-PLGABSA-FITC-NPs纳米颗粒进行小型猪噪声性聋动物模型的内耳导入研究，为未来大型哺乳动物听功能干预研究提供重要的研究基础[26]。

2.2.2 遗传性聋在小型猪耳科动物模型的建立与应用过程中，科研团队定位、克隆出一种自发性先天性耳聋猪模型的致病基因，其临床表现与人类Waardenburg综合征2A型的特点类似[20]，通过研究证实其发病机制可能是由于MITF-M型基因突变,其内耳血管纹中间细胞缺失、毛细胞缺失、蜗管发育异常、螺旋神经节数量减少，导致其耳蜗内电位异常、听性脑干反应电位不能引出，为研究该病的机制和治疗提供了天然的模型[27-28]，对于研究干细胞移植等耳聋治疗措施的途径和方法也具有很大的帮助[29]。另外，通过ENU化学诱变小型猪的方法获得白色耳聋突变小型猪，并建立家系，对该家系的表型、听力及内耳形态学等方面进行评估，首次发现Mondini畸形小型猪模型及家系，为Mondini畸形的进一步研究提供了宝贵的动物模型。小型猪动物模型将为人遗传性聋的致病机理研究、临床治疗及药物筛选等提供重要的生物工具[29]。

2.2.3 听神经病通过实验研究发现ouabain溶液对小型猪螺旋神经节细胞有损伤，可导致听阈明显提高，且损伤程度具有浓度依赖性，但ouabain对毛细胞的影响不明显，此研究结果有助于通过使用ouabain溶液建立小型猪的听神经病动物模型。后续实验会进一步研究应用ouabain溶液时畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions，DPOAE)、耳蜗微音器电位（cochlearmicrophonics，CM）及内耳形态学等指标的变化，有望成功的建立人类听神经病的小型猪动物模型[30]。

2.3 以小型猪为动物模型开展人工听觉植入研究

2.3.1 人工耳蜗植入动物实验是验证新型人工耳蜗的必要步骤，小型猪耳蜗与人类类似，可以直接应用人类耳蜗电极进行植入实验，是非常合适的人工耳蜗实验动物模型[31-32]。传统耳蜗动物模型包括猫、豚鼠等，产生的实验数据不能完全反映人类用电极真实情况。通过用小型猪模型进行电子耳蜗植入研究，将国产电子耳蜗样机植入小型猪耳内，检验产品的安全性、有效性和稳定性，为临床患者的实际应用奠定基础，同时初步获得了耳聋猪的听力恢复数据[33]，为建立人工耳蜗大型哺乳动物实验植入平台奠定基础。

2.3.2 听觉脑干植入对于蜗后病变，包括螺旋神经节、听神经以及听觉中枢病变需要人工听觉脑干植入进行干预。经迷路入路提供最直接的进入耳蜗核及相关解剖的路径[32]，其手术复杂、风险较高，小型猪的听觉脑干结构类似于人类，通过在小型猪上模拟进行ABI的过程，可以进行手术模拟训练并验证效果，为临床应用奠定基础。

2.4 以小型猪为动物模型开展前沿治疗方法探索

2.4.1 干细胞治疗耳聋研究随着干细胞技术快速发展，干细胞移植治疗耳聋在小型猪动物模型中已取得一定进展。目前存在的主要问题包括移植径路的优化，既可将细胞移植损伤部位又可最大程度减小内耳损伤[34]。

目前已开展通过小型猪腰椎蛛网膜下腔穿刺-脑脊液途径移植干细胞治疗螺旋神经节细胞以及听神经的病变。实验研究发现经蛛网膜下腔注射途径移植人脐带间充质干细胞可以迁移至耳蜗,并对其听性脑干反应造成影响[35]。对于毛细胞、听神经都有病变的感音神经性耳聋，干细胞移植联合植入人工耳蜗,有望达到更好重建听力的效果。

2.4.2 基于活体基因组编辑的基因治疗技术探索

在成功建立小型猪耳聋动物模型基础之上，探索基因治疗的相关研究[36]，包括利用腺相关病毒(adreno-associated virus，AAV)将CRISPR/Cas9导入到早期MITF-/-荣昌猪的内耳组织中，以期修复MITF基因的突变，实现基因治疗。目前为实现CRIS-PR/Cas9在猪基因组中的高效、定点编辑，已利用猪的成纤维细胞在体外水平筛选出针对荣昌猪突变的高效切割位点，基因组编辑的效率可达到约50%。下一步的工作将集中于CRISPR/Cas9的导入时机和方式以及导入后表型变化的测定[36]。

随着对猪与人类在解剖和功能方面相似性的认识逐步加深，小型猪作为耳科新型动物模型应用日趋成熟，开辟了耳科动物模型的全新领域，有可能引起耳科学基础研究革命性变化。以此为基础建立的各种耳聋、眩晕发病机制研究平台、人工耳蜗植入实验平台、干细胞及基因治疗实验平台，具有基础医学向临床医学应用转化的价值，在听觉及前庭基础研究以及临床耳病相关研究方面的应用前景十分广阔。目前由于小型猪新型耳科动物模型出现较晚，应用不够广泛，尚需进一步加强其在耳科研究中的推广与应用。