上皮-间充质转化在口腔鳞状细胞癌发生、发展中作用的研究进展

周锦翰 刘传霞 葛巍立 何虹

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是颌面部最常见的恶性肿瘤之一。OSCC有较强的侵袭性，易发生颈部淋巴结转移，原发病灶扩大切除、同期颈淋巴结清扫是常用的手术方式。由于术区集中在颌面部，此类手术通常会对患者的面部容貌产生较大影响，严重者需切除部分甚至全部的上、下颌骨，严重影响口颌功能与面部美观[1-2]。由于OSCC浸润性强、易转移的特点，该类患者的预后较差，5年生存率约为50%[3-4]。因此，深入研究OSCC侵袭、转移的分子生物学机制对降低肿瘤复发率、提高患者生存率具有重要的临床意义。OSCC侵袭、转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程，细胞相互之间松解、运动能力增强是侵袭与转移的基础[5]。其中，上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是这一过程的主要因素。本文就EMT在OSCC发生、发展中作用的研究进展作一综述。

1 EMT概述

EMT是指上皮细胞向间充质细胞转化的过程，这一过程通常是可逆的，常见于胚胎发育和瘢痕组织的形成过程中[6]。在经历了EMT的上皮细胞中，细胞骨架发生了重组，细胞外基质溶解，失去了与邻近细胞的连接并且向周围的组织运动。从蛋白质表达上来看，发生EMT的细胞下调了上皮标志物，包括E-钙黏蛋白（E-cadherin）、桥粒蛋白（desmoplakin）、细胞角蛋白、紧密连接蛋白（Claudins）、β-连环蛋白（β-catenin），与此同时，间充质标志物的表达上调，如N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（Fibronectin）、锌指转录因子（Snail1/2）[7-8]。从形态学上来讲，细胞从典型的铺路石样不规则立方样转变为长梭形的间充质样表现[9]。钙黏附蛋白转化对这一过程有极大的影响，即从E-cadherin转变成为N-cadherin，E-cadherin是上皮细胞间主要的黏附分子，对维持上皮细胞形态有重要的作用[10]。调节这一过程的转录因子非常复杂，主要有锌指转录因子家族（Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、Twist等）。有学者发现，在OSCC细胞的体外实验中，转染了Snail的上皮完整表现了EMT的过程，最终呈现为E-cadherin减少、N-cadherin和Vimentin增加、半桥粒缺失的成纤维细胞样形态，同时ZEB1、ZEB2的表达同样上调[11]。

2 EMT在OSCC发生、发展中的作用

研究发现，在肿瘤组织中，EMT非常活跃，表现为肿瘤上皮细胞连接松解，上皮特异性标志物E-cadherin表达下降，细胞外基质降解，细胞逐渐开始游离并可进入临近组织，运动能力增加，上皮细胞的极性消失，同时表达间充质细胞的分子标志物，如Vimentin、N-cadherin、Fibronectin等[12]。除此以外，在发生上皮异常增生的口腔黏膜中也可以观察到此类现象的发生，且上皮异常增生越严重，E-cadherin的表达越低；同样的，随着病变的进展，在正常口腔黏膜、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生、OSCC组织中，Vimentin的表达整体呈上升趋势，说明在OSCC的发生过程中就已经出现了EMT[13]。

有研究表明，EMT促进了肿瘤的侵袭和转移，增加了肿瘤复发的风险，降低了患者的预后和生存率[14]。Nguyen等[15]发现在头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous carcinoma，HNSCC）的体外实验中，N-cadherin的表达明显上升，并且高表达N-cadherin的HNSCC在生物学行为上表现出更强的侵袭性。在OSCC组织和正常癌旁组织的交界处，表现出细胞分裂、分化从有序到无序的转变，因此有学者将这一区域称为肿瘤侵袭前缘（tumor invasive front，TIF）。在 TIF中，部分细胞处于半-间充质的状态，间充质细胞标志物Vimentin出现了异常的高表达，同时细胞的运动能力增加[16]。Miyazawa等[17]发现在OSCC的TIF中，上皮细胞异位表达了间充质细胞特异性转录因子（mesenchymal specific transcription factor，HMGA2），并且HMGA2的表达量与OSCC患者的复发率和生存情况显著相关，HMGA2不仅说明了OSCC上皮细胞经历了EMT，同时肿瘤的侵袭性也得到了增强，其表达情况可以用于判断肿瘤患者的预后。

3 EMT与TIF相关的信号通路

3.1 转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族与EMT TGF-β超家族是调节细胞EMT活动的经典途径之一，包括TGF-β配体（TGF-β1/2/3）以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）。TGF-β本身功能多样，即使在同一细胞系中也能引起不同的细胞反应，在正常的上皮细胞和肿瘤早期细胞中，TGF-β表现为肿瘤抑制，然而随着病程的进展，TGF-β又可以作为肿瘤发展的促进因子。该信号通路在上皮细胞中通过丝/苏氨酸激酶跨膜受体（TGFβRⅠ、TGFβRⅡ）传递分子信号，在受体与配体结合后，TGFβRⅡ磷酸化TGFβRⅠ，后者继续磷酸化细胞质内的受体调节性 Smads（R-Smads），在经典 TGF-β 通路中，R-Smads通常为 Smad2/3，在 BMP通路中则为Smad1/5/8，随后磷酸化的R-Smads与Smad4结合，转运至细胞核内，调节相关基因的表达[18－20]。Saika等[21]首先在晶状体上皮的体外实验中发现了EMT的过程，随后通过构建Smad3沉默的小鼠模型，发现缺少Smad3的小鼠的晶状体上皮在受到外界刺激时不能转变成间充质形态，同时EMT标志物Snail、α平滑肌肌动蛋白的表达下降。Smad7可以通过抑制Smad2/3的磷酸化而阻断TGF-β通路，将Smad7的cDNA转染到细胞内，受外界刺激的晶状体上皮细胞本该进行的EMT活动减弱甚至消失。在OSCC的相关研究中，有学者发现肿瘤出芽与TGF-β信号分子之间有密切联系，肿瘤出芽是指在TIF区域中散在分布于间充质中的单个或少于5个小簇状肿瘤细胞。Xie等[22]在2015年回访了195例处于病变早期（T1/2N0）的舌鳞状细胞癌患者，在组织病理切片上统计了TIF区域中肿瘤出芽的情况，结果显示肿瘤出芽的数量和密度与颈部淋巴结转移、复发率、侵袭深度密切相关。Jensen等[23]则对该现象的分子生物学机制进行了进一步研究，免疫组织化学和PCR检测结果显示在肿瘤出芽区域中EMT的引导物ZEB1和配对相关同源基因的表达均增加，上皮标志物E-cadherin则减少，而间充质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET）标识物OVO样蛋白1的表达则显著减少。大规模平行RNA测序显示TGF-β是上游最活跃的信号分子，在加入了TGF-β刺激后，超过32%的基因表达情况与TGF-β 信号相一致[24]。

TGF-β超家族中的另一转录因子BMP同样在OSCC组织的TIF区域中发挥了重要作用。Chiba等[25]在4 种 OSCC 细胞系（HSC2、HSC3、HSC4、SAS）中检测了TGF-β1和BMP2的表达情况，发现HSC4细胞对BMP2的刺激反应较明显，主要表现为Smad1/5/9目标基因的上调，如MET引导物分化抑制因子1和细胞角蛋白9；因此选择HSC4细胞系来进一步研究BMP2对EMT的影响，发现在BMP2处理后1 h，Smad6和ID1的表达开始升高，3 h后到达最高点，且在此过程中磷酸化的Smad1/5/9含量显著增加。RT-qPCR检测结果显示在经过BMP2处理后，上皮标志物CK9的表达显著升高，而N-cadherin则受到明显抑制，与此相反的是，在加入TGF-β1之后,上皮标志物CK18受到抑制，N-cadherin和Vimentin则表现为高表达。截止目前，该研究证明了TGF-β1能够促进上皮向间充质的转化，而BMP2则是逆向推进了该过程。与此相反的是，Qiao等[26]发现在BMP4的作用下，Tca8113细胞系（人类舌鳞状细胞癌）从铺路石样逐渐转变为梭形，EMT标志物Snail、Slug、Vimentin表达上调，E-cadherin下调，并且有部分细胞转变成为肿瘤干细胞样形态（cancer stem cell，CSC），CSC的标志物表达明显上调，如乳腺癌抵抗蛋白、人端粒酶逆转录酶、CD44、B细胞特异的莫洛尼白血病毒插入位点1等。在其他种类的鳞状细胞癌中，CSC已经被证明可以直接导致肿瘤的发生，同时在肿瘤的生长和治疗后的复发过程中也起到了重要作用，因此BMP4可能是通过EMT来促进CSC的形成来增强OSCC的侵袭和转移。

3.2 胞内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路与EMT PI3K/Akt信号通路同样能调节OSCC细胞的EMT[27]。Grille等[28]在SCC13和SCC15中通过转染腺病毒使其能持续表达Akt，成功转染后细胞形态发生了改变，E-cadherin、桥粒蛋白、β-catenin等细胞间黏附分子表达减少，Vimentin表达上调，细胞运动能力增强，同时转录抑制剂Snail的表达增加，提示Akt可能是通过Snail来抑制E-cadherin的表达。

3.3 Wnt/β-catenin信号通路与EMT 研究发现，βcatenin在OSCC细胞质中的异常聚集可以上调基质金属蛋白酶7的表达及EMT，这一结果证明了Wnt信号分子与肿瘤的侵袭和转移也有密切关系[29]。有研究者收集了57例OSCC组织标本，与57例正常口腔黏膜组织进行了对比，免疫组织化学和RT-qPCR检测结果显示OSCC组织中同源盒基因（homebox C10，HOXC10）过表达，且高表达HOXC10的患者5年生存率显著降低，体外实验显示将HOXC10的shRNA转染到SCC4细胞系中，使该细胞不表达HOXC10，SCC4细胞增殖和迁移能力与对照组相比显著下降；进一步研究发现，在HOXC10沉默的细胞中，Wnt通路下游的Wnt10b、蓬乱蛋白Dsh同源物2、脂蛋白受体相关蛋白-6、脂蛋白受体相关蛋白-5的表达减少，其中Wnt10b的下降尤其显著，与此同时，E-cadherin表达上升，N-cadherin和Vimentin表达下降，说明HOXC10可能通过Wnt信号通路来反向调节OSCC中的EMT[30]。

4 EMT在OSCC化疗耐药中的作用

OSCC的一线化疗方案是顺铂，初始治疗后大部分肿瘤得以清除，但是超过30%的患者会在5年之内复发[4，31]。研究表明，肿瘤细胞可以通过获得间充质表型而产生对顺铂的耐药，说明EMT可能是诱发化疗耐药的重要原因之一[32]。多重耐药基因能够通过表达特定的蛋白从而使长时间暴露在化疗药物中的肿瘤细胞向细胞外转运药物分子，细胞内药物浓度下降，从而形成化疗耐药[33-34]。有研究显示，顺铂耐药的OSCC细胞系中多重耐药基因长时间处于过表达的状态，与此同时也发现了EMT转化的现象，细胞形态从圆形向梭形转变，N-cadherin表达上升，细胞活动性增加等[31]。EMT相关的转录因子可以与药物排出泵结合，如Twist直接结合于E盒位点表面，人巢蛋白1通过刺激细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路，诱导细胞发生EMT，上调药物排出泵MDR1和ABCG2，产生顺铂耐药[35-36]。长链非编码RNA可以在表观遗传调控、转录调控、转录后调控等多层面上调控基因的表达[37]。MALAT1作为经典的致癌基因，在肿瘤的生长、侵袭、转移中都发挥了重要作用，近年来有学者发现，与正常的OSCC细胞相比，高表达MALAT1的OSCC细胞出现了顺铂耐药，后续研究表明，MALAT1可能是通过PI3K/Akt/m-TOR通路诱导产生EMT及耐药现象[38-43]。

5 小结

近10年，大量的研究者在EMT的生物学机制、功能、应用能方面都进行了深入的研究，EMT已经被视为肿瘤侵袭、转移的标志性事件。然而由于EMT这一过程高度异质，大量的转录因子和miRNA都被证明参与其中，因此其影响肿瘤侵袭、转移的确切过程和作用仍有待阐明。随着肿瘤分子生物学的发展，EMT可调控的生物学机制越来越多样化、越来越复杂，在提高了研究难度的同时，也为干预这一行为提供了更多的选择。深入研究OSCC中EMT与肿瘤侵袭、转移的相关调控机制，有助于未来在临床上更有效的开展靶向治疗。