补肾益精汤对弱精症大鼠精子线粒体功能的影响及其相关机制研究

王世平，李倩云，崔言秀，吕 涛，徐光玉，王策正

随着环境污染、社会压力增加，男性不育症的发病率越来越高，而弱精症是男性不育症的重要原因。一直以来，中医药在少弱精子症的临床治疗中发挥了重要的作用，但因成分复杂，其确切的作用机制以及靶点尚不十分清楚。补肾益精汤是著名的中医专家亓绪武先生的方剂，在临床应用中疗效明确，能够显著提高患者精子活力以及配偶受孕率。本研究将探讨补肾益精汤对大鼠精子线粒体呼吸功能以及能量代谢的影响，并在精子特异性钙通道CatSper1层面对其作用机制进行分析。

1 资料与方法

1.1 动物 健康成年清洁级雄性SD大鼠100只，体质量(200±24) g，青岛大学中心实验室提供，质量合格证号：SCXK(鲁)20170110。适应性饲养1周后，采用随机数字法将大鼠分为正常对照组（A组）、雷公藤多苷组（B组）、生理盐水组（C组）、左卡尼汀组（D组）及补肾益精汤组（E组），每组20只。

1.2 药物及试剂 补肾益精汤：黄芪40克，当归10克，枸杞子、菟丝子、车前子、五味子、覆盆子、淫羊藿各15克，熟地20克。由泰山医学院附属莱芜医院中药房煎制，用0.9%生理盐水将浓度稀释成1 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。雷公藤多苷由浙江省普洛康裕天然药物有限公司生产（批号：20170801）。用0.9%生理盐水将浓度稀释成1 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。左卡尼汀购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司(50 mg/支, 国药准字H19990372)，按成人说明书口服剂量，用生理盐水分别稀释成50 mg/mL，置于4 ℃冰箱备用。细胞线粒体分离试剂盒、线粒体呼吸测定试剂盒以及ATP检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，CatSper1和GAPDH基因扩增引物购自上海生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 高速低温离心机：美国Beckman公司；全自动精子分析仪：北京伟力有限公司；超低温冷冻冰柜：日本索尼公司；细胞计数板：上海益恒实验仪器有限公司；组织匀浆器：海门天龙实验器材厂；多功能酶标仪M5：美谷分子仪器有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 用药方法 A组大鼠每日灌胃生理盐水[1 mL/(kg·d)]，B、C、D、E组每日灌胃雷公藤多苷[20 mg/（kg·d）]，共21 d，处死A、B两组大鼠，然后C组每日灌胃生理盐水[1 mL/(kg·d）]，D组每日灌胃左卡尼汀[50 mg/（kg·d）]，E组每日灌胃补肾益精汤[3 g/（kg·d）]，共35 d，处死C、D、E三组大鼠。用药过程中，B组、E组死亡各1只，D组死亡2只。

1.4.2 精子标本的获取 摘取大鼠附睾置于清洁培养皿中，加入2 mL 37 ℃生理盐水，用无菌剪刀将附睾剪成碎块后，移入试管中，用Percoll分离法优化精子备用。取同等体积的优化精液8 µL放置于载玻片，进行精液常规精子运动轨迹分析。线粒体的分离、细胞线粒体呼吸控制率（RCR）测定、ATP含量测定均严格按照所购买的试剂盒说明书严格操作。应用RT-PCR技术测定CatSper1 RNA含量，操作严格按照RT-PCR试剂盒操作。具体如下：（1）精子总RNA制备。（2）引物设计。PCR扩增引物由上海生物工程有限公司设计并合成。见表1。（3）逆转录合成。反应条件：Cat Sper 1反应：依次进行：94 ℃、1 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，36个循环，72 ℃、10 min。GAPDH 反应：94 ℃、1 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、45 s，34个循环，72 ℃、10 min。（4）电泳及结果分析：载体：2%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液。PCR产物4.0 μL与10×载体样缓冲液1.0 μL混匀，点样，80 V稳压电泳45 min，在凝胶成像仪上观察、拍照。应用 Quantity One软件进行半定量分析。

表1 基因扩增引物序列

1.5 统计学处理 数据采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验；采用Pearson相关分析E组RCR、ATP分别与CatSper1 RNA含量的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠精液参数比较 与A组比较，B组的精子密度、a+b级百分率及存活率均明显下降，弱精症动物模型制作成功。与C组比较，D组、E组的精子三项指标均有所提高，且E高于D组，差异均有统计学意义（P＜ 0.01），见表2。

表2 各组大鼠精液参数比较

2.2 各组精子RCR、ATP及CatSper1 RNA含量比较 B组RCR、ATP及CatSper1 RNA均低于A组（P＜0.01）。与C组比较，D组、E组精子RCR、ATP及CatSper1 RNA均有所提高，E组高于D组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 各组大鼠精子RCR、ATP及CatSper1 RNA含量比较

2.3 Pearson相关性分析 E组的RCR、ATP含量与CatSper1 RNA均呈正相关（r=0.912、0.893，P＜0.05），见图 1。

图1 E组大鼠ATP、RCR含量与RNA含量的相关性分析

3 讨论

弱精症是男性不育的重要原因，发病机制错综复杂，一直是研究的热点。虽然国内外学者对其进行了大量的研究，但其确切的原因尚不清晰[1]。在弱精症的众多研究中，动物模型起到了重要的作用。其中，雷公藤多苷诱导的弱精症动物模型因其操作简便，特异性高，成模时间短，对模型动物伤害较小等特点，应用比较广泛[2-4]。目前，众多研究者分别在病理学、形态学、分子生物学、内分泌机制以及遗传学等各个方向分别阐述了雷公藤多苷诱导生精障碍的机制。其诱导的弱精症大鼠模型也逐步广泛应用于弱精症的各项研究中[5]。本研究应用雷公藤多苷[20 mg/（kg·d）]灌胃大鼠21 d，通过检测大鼠附睾精子的运动参数，证实弱精症模型制备成功。

线粒体是通过三羧酸循环以及氧化磷酸化合成ATP为精子细胞提供能量的，其是精子细胞最重要的细胞器之一。线粒体的功能状态对精子细胞的运动能力，特别是快速前向运动及前向运动能力起决定性作用[6-7]。精子细胞作为终末细胞，在形成过程中丢弃了绝大多数的细胞器，只保留了重要的线粒体和高尔基体，因此，线粒体的作用十分突出，不但能为精子提供生存以及运动的能量，还在钙离子的平衡调节、细胞的程序性死亡过程中发挥了重要的作用[8]。CatSperl作为精子细胞特异性钙通道，目前已经被证实是精子细胞尾部鞭毛钙离子内流的主要通道，在对精子超活化过程中起到决定性作用。CatSperl缺失的精子，其运动力明显减弱，快速前向运动基本消失，前向运动也被大量抑制，其尾部不能弯曲，缺乏有力地“鞭打”[9]。在本课题的前期研究中，笔者先后对弱精症大鼠的精子细胞线粒体的呼吸功能与ATP的含量进行测定，并通过基因敲除技术将CatSperl基因敲除后发现，精子细胞线粒体的呼吸功能与能量代谢与CatSperl存在密切相关性[10]。

中医理论中，精子的物质基础为肾精，精子运动的动力来源为肾气，弱精子症主责为肾精弱气虚。中药方剂在肾精弱气虚的治疗实践中形成并完善了辨证辨病、因症因病因人施治的一系列理论。补肾益精汤是著名中医专家亓绪武先生的方剂：黄芪40克，当归10克，枸杞子、菟丝子、车前子、五味子、覆盆子，淫羊藿各15克，熟地20克。以五子衍宗丸为基础，增加淫羊藿、黄芪等相关佐剂，每日1副，30日为一疗程，在临床应用过程中效果显著。五子衍宗丸作为经典名方，临床应用中能够显著改善患者的精液质量。主要表现在提高精子密度、提高精子运动能力，减少精子畸形率，增加配偶的怀孕几率[11]。黄芪的主要成分为黄芪总多糖（TPA）、黄芪总皂苷（TSA）以及黄芪总酮（TFA），在辅助生殖技术中应用广泛。研究发现黄芪具有抗氧化应激作用，并且在精子细胞钙离子的调节中发挥一定的作用[12]。淫羊藿的主要成分是淫羊藿苷，在弱精症的治疗方剂中应用较多，能直接刺激性腺，促使睾酮分泌增加，增加雄性生殖能力[13]。当归富含天然的植物性荷尔蒙，现代生物研究发现其也直接消除自由基，抑制氧化反应和自由基反应等过程中发挥了重要作用[14]。熟地是六味地黄丸的主要佐剂之一，治疗肾阳不足，畏寒肢冷，命门火衰，小便遗沥，阳痿遗精[15]。

本研究通过制作弱精症大鼠模型，给予弱精症大鼠灌胃补肾益精汤，发现补肾益精汤可以明显增加精子运动能力以及存活率。通过检测发现精子RCR、精子细胞ATP的含量及CatSperl含量均明显增加，且CatSperl与RCR、ATP之间呈正相关。提示补肾益精汤通过提高精子线粒体的呼吸功能和能量代谢进而改善精子质量，而精子特异性钙通道CatSperl可能是其作用靶点之一。