桃核承气汤对LPS诱导血管内皮细胞炎症因子及TLR4、TRIB3表达的影响

卢增珍，刘国涛，郭燕玲，刘 鹏，卢庆威，王 军

糖尿病下肢动脉硬化闭塞症（diabetes lower extremity arteriosclerosis obliterans, DLASO）是糖尿病足溃疡难愈和截肢高风险的主要原因，腔内介入治疗是目前治疗首选方案，但术后再狭窄发生给临床治疗带来巨大挑战，再狭窄发生与术后血管内皮损伤，局部炎症反应，血管平滑肌细胞增殖、移行及内膜增生等相关[1]。血管再狭窄发生与炎症因子具有相关性，通过针对炎症因子的治疗可防治术后血管再狭窄[2]。本课题组前期研究发现桃核承气汤能抑制炎症因子的释放、降低致纤维化因子TGF-β表达，对糖尿病大血管纤维化有改善作用，其中桃仁能降低TRIB3 mRNA及TLR4 mRNA表达[3-5]。本研究拟通过体外细胞实验探究桃核承气汤含药血清对损伤血管内皮细胞炎症因子及TLR4、TRIB3表达的影响，为中医药防治DLASO血管再狭窄提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 8周龄雄性SD大鼠30只，体质量（200±20）g，购自中国食品药品检定研究院实验动物资源中心，动物合格证号SCXK（京）2017-0005。大鼠主动脉血管内皮细胞株购于北纳生物科技有限公司（编码BNC337896）。

1.2 药物 桃核承气汤（桃仁12 g，大黄12 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，芒硝6 g，以上药物为颗粒剂，由四川新绿色药业科技发展有限公司生产，批号19016264）。颗粒剂溶于蒸馏水，加热融化，含有效药物原生药材浓度为4.5 g/mL，即配即用，常温灌胃。0.9%氯化钠溶液，国药准字：H37022336，山东辰欣药业股份有限公司。

1.3 主要试剂与仪器 脂多糖（LPS）购于sigma公司，货号L2880；BI胎牛血清 GIBCO，货号04-102-1A；DMEM高糖培养基，货号C11960500BT；Hycllone双抗，货号15140-122。PCR引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成（引物序列见表1）；荧光定量PCR仪（7500 FAST Real-Time PCR System）为美国Thermo公司产品；酶标检测仪（KHB ST-360）为上海科华实验系统有限公司。

1.4 含药血清制备 将30只SD大鼠随机分为生理盐水组（n=15），桃核承气汤组（n=15）。根据成年人和大鼠体表面积转换公式，大鼠等效剂量约为成年人的6.3倍。桃核承气汤组予灌胃1 mL/(100 g·d)颗粒剂，生理盐水组予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，予每日定时（8时、16时）灌胃，连续7 d，于第7天最后一次灌胃1 h后取大鼠腹主动脉血，室温下静置2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，56 ℃恒温水灭活30 min，-80 ℃冰箱保存备用，含药血清制备参考王志高[6]制备方法。

1.5 细胞培养 大鼠主动脉内皮细胞株置于DMEM高糖培养基(10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素)于5% CO2，37 ℃条件下培养。

1.6 分组与干预 将细胞传代培养，生长融合成单层细胞，胰酶消化并计数，接种于96孔板（每孔3×104个细胞），24 h后倾去培养液，PBS清洗2～3遍，将细胞随机分为4组，正常组、正常加药组、模型组、模型加药组。分别用生理盐水组大鼠血清（89%培养液+10%大鼠血清+1%青霉素/链霉素），桃核承气汤组大鼠含药血清（10%），LPS（1 μg/mL）+生理盐水组大鼠血清（10%），LPS（1 μg/mL）+桃核承气汤组含药血清（10%）干预细胞。

1.7 ELISA 法检测IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白表达水平 将主动脉内皮细胞种于6孔板中，每孔6×105个细胞，根据实验分组情况予以相应因素处理，在干预48 h后收集各组细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书步骤分别进行IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白检测的含量。

1.8 qPCR检测IL-1β、IL-6、TGF-β、TRIB3、TLR4的mRNA表达 将主动脉内皮细胞种于6孔板中，每孔6×105个细胞，根据实验分组予以相应因素处理，培养48 h后，按试剂盒说明操作，分别提取各组细胞株的总RNA，以提取的RNA为模板，按qPCR试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，40循环。将扩增的cDNA加入至20 μL反应体系。引物序列见表1。

荧光定量PCR循环温度为：94℃ 4 min, 94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s 40 个循环，然后 65 ℃ 5 s、95 ℃ 5 min。以β-actin 作为内参基因，目的基因的表达根据经qPCR 仪器检测的Ct值，通过公式Folds=2-ΔΔCt进行相对定量分析，计算mRNA 表达水平。

1.9 统计学方法 使用SPSS21.0统计软件进行数据处理，计量资料用±s表示，组间比较采用方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时选用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA 法检测IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白表达 与正常组比较，模型加药组IL-1β表达显著升高，IL-6、TGF-β表达升高，与模型组比较，其余三组的IL-1β、IL-6表达明显抑制，模型加药组TGF-β表达显著上升，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2及图 1。

表1 引物序列

表2 各组IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白表达水平比较

图1 细胞培养上清液中各组IL-1β、IL-6、TGF-β表达水平

2.2 qPCR检 测 IL-1β、IL-6、TGF-β、TLR4、TRIB3的mRNA表达水平 与模型组比较，模型加药组IL-1βmRNA表达抑制，其余三组IL-6、TLR4的mRNA表达下降，而TGF-βmRNA表达升高，正常组和正常加药组TGF-βmRNA降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3及图2。

表3 各组IL-1β、IL-6、TGF-β、TLR4、TRIB3的mRNA表达水平比较

图2 各组IL-1βmRNA、IL-6mRNA、TGF-βmRNA、TRIB3mRNA、TLR4mRNA相对表达量

3 讨论

DLASO是糖尿病患者严重并发症，病变部位主要为膝下动脉，易出现远端肢体的缺血坏死、溃疡难愈、截肢等风险，随着血管介入治疗手段的发展，解决临床问题的同时带来新的挑战，动脉硬化闭塞血管支架置入术或经皮腔内血管扩张成形术（PTA）后易出现血管再狭窄，血管再狭窄发生机制与炎症反应密切相关，腔内术后易出现血管结构损伤和内皮细胞功能紊乱，从而诱发炎症反应，炎症因子释放促进内膜过度增殖和细胞外基质沉积，促进血管再狭窄的病理进展[2]。临床研究报道冠脉支架术后再狭窄（ISR）发生患者IL-6 水平均较未发生 ISR 者明显升高，抑制炎症因子的表达可降低ISR的发生，中医药在防治ISR发生方面具有良好的临床疗效[7]。鞠上等[8]报道中药益气活血、化痰解毒，能防治糖尿病下肢血管病变PTA术后再狭窄。

本课题组前期研究发现桃核承气汤能够抑制炎症因子的释放，本研究采用桃核承气汤含药血清为药物干预。桃核承气汤出自《伤寒论》，由桃仁、大黄、桂枝、炙甘草、芒硝组成，具有逐瘀泻热功效。桃仁能活血破瘀，大黄泻下清热，芒硝泻热软坚，桂枝温通血脉，防治大黄、芒硝寒凉之性，防治血液凝集，甘草调和药性，缓和诸药峻烈之性。现代医学研究发现桃核承气汤具有活血祛瘀功效，能畅通血管，祛瘀消滞的作用，对动脉粥样硬化模型鼠的炎症因子有明显的抑制作用[9]。动物兔实验研究发现桃核承气汤对动脉硬化闭塞球囊扩张后再狭窄有防治作用[10]。基于网络药理学研究发现桃核承气汤防治2型糖尿病的作用是多靶点、多通路的，具有改善胰岛素抵、降糖、调整脂质代谢、抗炎等作用[11]。

LPS是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，能诱导主动脉内皮细胞损伤，LPS诱导制备主动脉内皮细胞损伤模型[12]。本研究发现，与正常组比较，模型组炎症因子IL-1β、IL-6表达升高，抑炎因子TGF-β表达降低。加入桃核承气汤含药血清后，炎症因子IL-1β、IL-6明显抑制，TGF-β表达显著升高，TLR4mRNA相对表达量降低。可见，桃核承气汤含药血清能抑制主动脉内皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6的释放，同时促进抑炎因子TGF-β表达，桃核承气汤含药血清抑制炎症可能通过作用于TLR信号通路，减少TLR4mRNA的表达，进而下调IL-1β、IL-6炎症因子有关。从而发挥LPS诱导主动脉内皮细胞损伤的保护作用。刘云涛等[13]也发现桃核承气汤通过减少TLR4mRNA和CD4mRNA表达，下调IL-6等炎症因子，具备减轻脓毒血症大鼠小肠组织炎症损伤。Toll样受体4（TLR4）为I型跨膜蛋白，在信号介导过程中发挥重要作用，分布广泛，在微血管内皮细胞、心肌细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等均有分布，LPS可作为其配体，相结合可发生系列生物学效应。大量文献研究发现[14-16]，TLR4信号通路激活后可合成白细胞介素家族中的炎症因子，参与动脉粥样硬化过程，能加速平滑肌细胞增生，刺激斑块形成，参与血管炎症和血管重构过程中。本研究发现桃核承气汤含药血清抑制TLR4mRNA表达，下调IL-1β、IL-6炎症因子，上调TGF-β因子，抑制血管内皮细胞炎症表达，可能在糖尿病下肢动脉硬化闭塞症中发挥抑制炎症反应，减少ISR发生。