血清HBV pgRNA与HBV cccDNA的关系及其临床意义研究进展

张诗琬，喻雪琴，陈芳，陈星，戢敏，梅小平

川北医学院附属医院，四川南充637000

以乙肝病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)为模板进行HBV RNA逆转录是HBV复制的初始环节，HBV cccDNA的存在是HBV持续感染的标志[1,2]。目前，即使患者血清中HBV DNA、乙肝表面抗原(HBsAg)消失或发生血清学转换，但肝细胞核中仍存在HBV cccDNA而无法被药物清除，肝细胞核内少量HBV cccDNA即可导致HBV相关性肝病患者病情复发。由于HBV cccDNA存在于肝细胞内，需要进行创伤性肝穿刺活组织检测，且HBV cccDNA在肝内呈不均匀分布，因此HBV cccDNA的精准检测难以在临床中广泛开展，临床上亟需寻找新的血清标志物来准确反映肝组织中HBV cccDNA的表达水平以及转录程度。2018版欧洲肝病学会《慢性乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南》及2019版《慢性乙型肝炎防治指南》中均增加了3种新型HBV检测生物学标志物，其中包括血清HBV前基因组(HBV pgRNA)[3]。但目前血清HBV pgRNA检测并未在临床推广应用，可能与其在血清中表达较低、相关研究数据少及尚未形成统一检测标准等有关[4]。本文就血清HBV pgRNA与HBV cccDNA的关系及其临床意义作一综述。

1 血清HBV pgRNA与HBV cccDNA的关系

1.1 血清HBV pgRNA概述 德国学者Kock等[5]在1996年从CHB患者血清中首次检出了HBVRNA，随后HBV RNA迅速成为国内外学者的研究热点，关于HBV RNA的相关报道不断出现。Tanaka等[6]利用蔗糖梯度离心法发现，HBV RNA与HBcAg、HBV DNA结构类似，并明确指出HBV RNA为乙肝病毒颗粒的核心成分。Wang等[7]利用免疫印迹技术排除相关干扰因素，发现在11例进行核苷(酸)类(NAs)药物初治的CHB患者血清中存在HBV RNA，是一种长度为3.5 kb的RNA；随后研究人员利用引物扩增及多重PCR技术，对接受NAs药物处理的HepAD38和HepG2.2.15细胞上清液进行检测，证实CHB患者血清中长度为3.5 kb的RNA就是HBV pgRNA。

以HBV cccDNA为模板转录出的HBV pgRNA在逆转录过程中会被降解，血清中HBV pgRNA的存在可能是因为NAs药物抑制了其逆转录过程，导致血清中HBV pgRNA累积而表达升高。研究发现，血清HBV pgRNA可能是肝细胞中的pgRNA在开始逆转录之前直接获得包膜，并从肝细胞中释放入血所致，因该病毒颗粒中含有HBV RNA，又称之为“HBV RNA病毒样颗粒”[8]。郭濛濛[9]对Nas治疗前后CHB患者血清HBV RNA水平进行对比发现，患者治疗后血清HBV RNA水平升高，并推测血清中存在的HBV pgRNA是由肝细胞核中的HBV cccDNA转录而来。

1.2 血清HBV pgRNA与HBV cccDNA的相互关系 HBV感染人体后即侵入正常肝细胞，随后HBV DNA脱去核壳成为松弛环状双链DNA(rcDNA)[10]。rcDNA是由正负两条链组成，负链中由几个碱基形成“缺口”，rcDNA进入肝细胞核后，在依赖HBV编码的DNA聚合酶作用下填补缺口，进行折叠、扭转等过程，成为超螺旋结构的HBV cccDNA[11]；同时细胞以HBV cccDNA为模板，转录出3.5、2.4、2.1、0.7 kb四种不同长度的mRNA，再合成多种病毒蛋白[11]。3.5 kb长的RNA有两种表达模式，一种为可编码乙肝e抗原(HBeAg)相关蛋白的pre-C mRNA，另一种为逆转录模板的pgRNA；该RNA可利用逆转录酶合成rcDNA中的负链，再以此为模板，在DNA聚合酶介导下合成正链DNA，正、负链DNA重新组合成为新的HBV rcDNA。新的HBV rcDNA一部分再入肝细胞核转化成为新的HBV cccDNA，另一部分与病毒蛋白重新组装释放到肝细胞外，成为有完整病毒颗粒的HBV DNA，再感染新的正常肝细胞[12,13]。因此，HBV pgRNA是HBV cccDNA的转录产物，以病毒颗粒形式表达于HBV相关性肝病患者的血清中。

2 血清HBV pgRNA检测的临床意义

2.1 反映HBV cccDNA的存在状态 HBV pgRNA在逆转录之前获得包膜，在感染肝细胞中以病毒颗粒方式释放入血。与HBsAg的多个来源不同，血清中HBV pgRNA的惟一来源是HBV cccDNA，每个感染HBV的肝细胞内均存在一定量HBV cccDNA，是HBV pgRNA的惟一转录模板。从理论上讲，血清HBV pgRNA水平可反映肝细胞HBV cccDNA水平及其转录活性，且血清HBV pgRNA检测方法简便易行、操作性强、患者易接受，是反映HBV cccDNA水平较为可靠的指标[2]。

自1998年应用NAs进行抗HBV治疗以来，临床上就存在患者抗HBV治疗停药后HBV复发率高的问题，抗HBV治疗还可引起酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)变异。郭濛濛[9]在找寻YMDD变异预测标志物时发现，发生YMDD的患者体内HBV pgRNA表达升高；表明血清HBV pgRNA高表达可能是HBV cccDNA的转录形式及HBV RNA肝内组装的标志，即检测血清HBV pgRNA表达对预测YMDD发生有一定预测价值。李惠姣[14]通过建立体外TDF抗病毒细胞模型，并观察细胞上清液HBV pgRNA、HBV DNA、HBsAg与细胞内HBV cccDNA的关系；结果发现，细胞上清液HBV pgRNA水平与HBV cccDNA呈显著正相关关系，且HBV DNA、HBsAg水平反映HBV cccDNA水平及复制转录的敏感度均明显低于HBV pgRNA。有报道指出，CHB患者肝组织HBV pgRNA与HBV cccDNA水平可反映患者体内HBV的复制水平，隐匿性HBV感染者HBV pgRNA与HBV cccDNA水平明显低于HBsAg阳性患者，表明HBV pgRNA与HBV cccDNA对HBV感染者体内HBV活跃程度的预测价值均高于HBsAg[15]。Lu等[16]对33例结束抗HBV治疗后的CHB患者进行血清检测，结果显示所有患者血清HBV DNA为阴性或低于检测下限，但仍有21例在随访24周后检出血清HBV pgRNA且均发生了病毒学复发；提示即使CHB患者血清中检测不到HBV pgRNA也不能表示肝细胞内HBV cccDNA消失或停止转录，但检测不到HBV pgRNA可使患者停药后的复发率大大降低。因此，对于慢性HBV感染者经过抗HBV治疗HBV DNA阴转之后的病情评估、疗效判断、停药时机选择及是否发生YMDD变异等，血清HBV pgRNA水平检测均具有非常重要的指导作用。

2.2 预测HBeAg血清学转换 研究发现，在CHB患者接受NAs治疗的过程中，HBV DNA下降到低水平时，HBeAg阳性者HBV pgRNA检出率高于HBeAg阴性者；这可能与HBeAg阳性者肝细胞内HBV cccDNA较为活跃有关，即血清HBV pgRNA水平可反映患者体内HBV的复制状态，HBeAg是影响血清HBV pgRNA水平的因素之一[19]。Berg等[20]研究发现，在采用阿德福韦酯进行抗HBV治疗的17例患者中，11例HBeAg阳性患者中有5例出现血清学转换，且与未发生血清学转换的患者相比，发生HBeAg血清转换者血清HBV RNA水平明显降低；该研究认为，血清HBV pgRNA可能成为预测HBeAg血清转换的指标之一，与Huang等[21]的研究结果类似。彭亚梦等[22]在HBeAg阳性患者血清中发现HBV pgRNA与HBeAg具有显著相关性，但在HBeAg阴性患者血清中并未发现此种相关性；提示HBeAg不仅可以从HBV cccDNA转录而来，还可由整合的HBV DNA产生。因此，HBeAg在反映患者疗效上有一定缺陷，而HBV pgRNA能直接准确地反映患者抗HBV治疗的近远期疗效。

2.3 反映乙肝核心相关抗原(HBcrAg)表达水平 HBcrAg是近年发现的HBV感染的新型血清检测标志物之一，是由前C基因及C基因编码的HBcAg、HBeAg、p22cr组成的组合性标志物，这3种蛋白质共拥有149个氨基酸序列长度，对于预测HBV感染者抗HBV治疗的疗效及选择停药时机具有重要的临床应用价值。Seto等[23]研究发现，HBcrAg可反映肝细胞内HBV cccDNA的水平及活跃程度，同时与血清HBV DNA及肝细胞内HBV DNA水平呈显著正相关关系，且相关系数高于HBsAg与HBV cccDNA之间的相关系数；表明作为HBV cccDNA的替代检测标志物，HBcrAg较HBsAg具有更高的价值。对HBsAg阴性的乙肝病毒携带者进行免疫抑制剂治疗时，患者发生HBV再活跃的重要因素就是血清HBcrAg阳性；提示HBcrAg可能成为患者接受预防性抗HBV治疗的重要评价指标，同时对患者抗HBV治疗后监测停药后HBV再复制的风险具有较高预测价值[24,25]。研究发现，CHB患者经NAs抗HBV治疗后，HBcrAg阳性者血清HBV pgRNA、HBV cccDNA及HBV DNA复制水平均明显高于阴性者，提示HBV pgRNA可在一定程度上反映HBcrAg表达情况[26]。血清HBV pgRNA、HBcrAg均可作为反映HBV cccDNA水平的无创性代替血清学指标，相比之下，HBV pgRNA来源惟一，是HBV cccDNA的直接产物，其准确性比HBcrAg更高。

2.4 反映HBV DNA、HBsAg水平变化 HBV DNA、HBsAg是目前诊断HBV感染最基本的血清学指标，有助于评估患者病情状况、预测抗HBV疗效、预测抗HBV应答程度和选择停药时机等。研究发现，血清HBV DNA及HBsAg可作为反映HBV cccDNA水平的无创替代血清学指标之一[27]。临床上CHB患者血清中HBV DNA消失或低于检测值下限后经巩固抗HBV治疗，其停药后复发率仍较高，这可能与肝细胞内HBV cccDNA没有被完全清除有关。HBV DNA是由HBV pgRNA逆转录而来，而HBV pgRNA由HBV cccDNA转录而来，即HBV DNA水平同时受到HBV pgRNA、HBV cccDNA水平的影响。NAs抗HBV治疗只作用于HBV的逆转录过程，可阻断HBV pgRNA逆转录，使HBV DNA合成受到抑制，但HBV cccDNA仍可以HBV RNA病毒样颗粒模式合成新的HBV颗粒。因此，NAs抑制CHB患者HBV pgRNA逆转录后，其血清HBV DNA水平下降，但HBV cccDNA下降缓慢，在HBV DNA低于检测值下限时，HBV cccDNA仍可能存在阳性表达[14]。

目前已有的抗HBV治疗方法尚达不到完全治愈的治疗目标，只能达到功能性治愈，即血清中检测不到HBV DNA、HBsAg，和(或)发生HBsAg血清转换。HBsAg主要是由HBV cccDNA发生转录后合成2.4、2.1 kb的mRNA翻译出来的病毒蛋白，抗HBV治疗并不能直接对其翻译过程产生阻断作用，因此患者血清HBsAg水平下降十分缓慢。Giersch等[28]研究显示，接受NAs治疗的患者血清中低水平的HBsAg还可能来源于HBV DNA。研究发现，HBsAg的来源不仅是HBV cccDNA，也可由整合的HBV DNA转录而来[29]。由于肝细胞更新周期长，导致来源于整合HBV DNA的HBsAg表达非常稳定，这导致了HBsAg用于反映HBV cccDNA水平和治疗效果的准确性较低。

2.5 预测抗HBV治疗疗效 肝细胞内HBV cccDNA存在是HBV持续或反复感染的最关键因素，肝细胞内低水平的HBV cccDNA是患者接受治疗后HBV复发的关键点。血清HBV pgRNA的唯一来源仅为HBV cccDNA，可作为HBV cccDNA转录产物、替代反映肝细胞内HBV cccDNA水平及HBV活跃程度的良好指标，对于评价抗HBV疗效、药物应答程度、停药时机选择、HBV基因突变与耐药及预测停药后复发风险、肝细胞癌发生风险和术后复发风险均具有较高价值。血清HBV pgRNA指标可反映肝组织病原学状态，创伤性小，患者接受程度高。

综上所述，新型血清标志物HBV pgRNA可反映HBV cccDNA的存在状态、预测HBeAg血清学转换、反映HBcrAg表达水平、反映HBV DNA、HBsAg水平变化、预测抗HBV治疗疗效等，在反映CHB患者病情、评估疗效、选择停药时机及预测停药后疾病复发风险等方面均具有较高的临床价值。但目前HBV pgRNA检测技术尚未完全成熟，仍处于大量研究阶段，且存在许多问题尚待解决，如HBV pgRNA是否能准确地反映HBV cccDNA的存在状态，HBV pgRNA作为停药指标的价值是否优于HBsAg等。未来利用逆转录PCR法对HBV pgRNA检测技术进行完善，再将其与HBsAg、HBcAg、HBcrAg、HBV DNA等指标结合，对CHB患者的综合评价体系将更加完善。