基于DNA条形码基因快速鉴定帕米尔高原南麓部分地区农田叶蝉

张海燕，陈光辉，张秀英，王玉涛

(1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什，844000；2.新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室， 新疆喀什，844000；3.喀什海关技术中心，新疆喀什，844000)

0 引 言

【研究意义】叶蝉属于半翅目，头喙亚目(Auchenorrhyncha)，角蝉总科(Membracoidea)，叶蝉科(Cicadellidea)[1]。该科昆虫分布广泛，全世界约1 500属，超过22 000种，中国约2 000种[2]。叶蝉属持久型传毒介体[3]，是一类对农林业威胁较大的害虫，可传播植物病毒病，如稻普通矮缩病、小麦红矮病、玉米线条病毒(由异沙叶蝉持久传播[4])等。对有害昆虫来说，种类鉴别、防控与监测尤为重要[5]，若不能及时准确鉴定而影响相应防治措施的采取，会对生态环境造成潜在的威胁[6]。叶蝉科昆虫有些类群形态相似，体色相当，在农林业害虫管治中，物种鉴定一直是制约生产的瓶颈[7]；有些体型和体色等特征易随发育阶段或地理环境的改变而改变[8]，遗传结构也会改变[9]，如额垠叶蝉属Mukaria[10]，增加了鉴定难度。叶蝉科昆虫高龄若虫较低龄若虫传病力强，成虫较若虫传病力强[3]，低龄叶蝉在若虫期较易防治，但该虫体型微小，幼虫形态特征差异小，有些特征在不同发育时期不稳定，对幼虫、蛹及卵采取形态鉴定法很难确保其准确性[11]。形态分类法受虫态、发育阶段、地理环境等影响，非专业人员很难快速、准确鉴定。DNA条形码技术能够克服形态学分类的不足，实现不同发育历期、不同形态、残体昆虫的快速准确鉴定。Hajibabaei 等[12]用DNA条形码技术对哥斯达黎加的鳞翅目3个科幼虫进行了有效识别，江亚杰等[13]用此技术对7种储粮害虫碎片进行了准确鉴定。研究选用线粒体基因对该区域的叶蝉进行分类鉴定，这对边境生物安全具有重要的意义。【前人研究进展】1993年Fang[14]首次将16SrDNA运用于角顶叶蝉的系统发育研究中，日本昆虫学家Kamitani[15]利用COI基因对日本45种叶蝉做了条形码研究；Dietrich等[16]应用28SrDNA序列探讨了角蝉总科的系统发育；美国国立生物技术信息中心共收录了该科42种叶蝉线粒体基因组数据，其中27种测定了全序列。李虎等[17]用COI基因对广头叶蝉亚科进行研究，发现序列A+T含量明显高于G+C。付建玉等[18]基于mtDNA COI，开展假眼小绿叶蝉研究，发现该种叶蝉种群间遗传距离为0.5%～1.2%，远小于2%的界限。杨金宏等[19]基于28SrDNAD2区，开展陕南凹缘菱纹叶蝉分子系统学与遗传多样性研究，孟泽洪等[20]基于Cytb基因序列，探讨大叶蝉亚科部分种类分子系统学，何宏力[21]开展了窗翅叶蝉分子系统学研究，詹洪平[22]通过分子技术和形态学结合的方法对圆痕叶蝉进行分析，确定了系统发育树中各属、种的地位。前人选择这些基因研究叶蝉，提供了DNA条形码，明确了叶蝉系统进化地位或分类地位，但是集中于COI基因，对Cytb、ITS2等基因的研究较少；我国目前对叶蝉的条形码研究尚不够全面，特别是帕米尔高原地区新的分类阶元有待发现。【本研究切入点】叶蝉科昆虫种类丰富，数量庞大，可传播植物病毒病，对农林业危害极大，有效防治较为困难，准确鉴定是有效防治的基础。由于该科昆虫体型小，种间形态相似，难以鉴定，帕米尔高原南麓山地区域叶蝉分布较多，已成为影响农林生产的害虫之一，而此地区有关叶蝉研究报道较少，帕米尔高原与阿富汗、巴基斯坦等国接壤，外来物种入侵时有发生，区域内对昆虫研究较少，叶蝉条形码研究鲜有报道。通过传统形态分类法，确定未知叶蝉的大致类群，选择mtDNACOI、Cytb和ITS2基因，运用通用引物PCR扩增并直接测序，借助生物信息学分析软件对比分析目的基因序列的相似性，构建系统进化树，分析遗传进化关系，获取叶蝉DNA条形码，实现不同种类叶蝉的快速鉴定。【拟解决的关键问题】研究利用DNA条形码技术，采用传统分类和分子生物学相结合，建立叶蝉快速鉴定方法，以弥补形态学分类的不足，丰富边境地区叶蝉基因数据库。

1 材料与方法

1.1 材 料

叶蝉样本于2019年6～9月，用捕虫网扫捕扫获得。在实验室进行形态学分类，获取试验标本7份，标记为A、B、C、D、E、F、G，将标本置于99%酒精离心管中，于4℃冰箱冷藏保存备用。表1

体视显微镜(Motic Cam2506 SMZ168)、PCR仪(Biometra TProfessional standard Gradient Thermocycler)、高速低温离心机(BECKMAN COULTERTM AllegraTM X-22R Centrifuge)、电泳仪(JY1600C)、水平电泳槽(美国Bio-Rad)、凝胶成像仪(Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR+凝胶成像系统)、振荡器(IKA MS3 digital)、恒温水浴锅等。

1.2 方 法

1.2.1 基因组 DNA 的提取

DNA提取参照邹志文等[23]Chelex改进方法，首先双蒸水清洗样品数次(期间漩涡振荡)，将清洗好的样品置于洁净滤纸上干燥，挑取单头样品置于1.5 mL的离心管中，用灭菌玻璃研磨棒充分研磨；加灭菌双蒸水0.5 mL，涡漩混匀，置冰箱-20℃冷却10 min，12 000 r/min离心5min，弃上清，重复3次；在沉淀中加入150 μL悬浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2 h；涡旋5～10 s，100℃加热10 min(封口)，取出后涡旋溶液5～10 s，10 000 r/min离心5 min，取上清作为PCR反应的模板，-20℃保存备用。

1.2.2 基因PCR 扩增

引物由北京奥科生物技术公司合成。扩增体系总体积为25 μL，其中Taq酶1.5 U，dNTP 0.25 mmol/L，1×反应缓冲液2.0 mmol/L Mg2+，上下游引物各为0.3 μmol/L，DNA 模板50 ng。反应步骤为：95℃预变性5 min，95℃变性45 s，56℃退火35 s，72℃延伸1.5 min，循环40次，循环结束后72℃延伸7 min。PCR产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。表2

表1 叶蝉样本采集信息Table1 Sample information collected in this study

表2 PCR 扩增引物设计及其参考文献Table 2 PCR primer design and its reference

1.3 数据处理

测序所获得的基因序列用Dnastar Package中的Editseq软件进行正反链拼接匹配校正，获得有效序列。在NCBI网站运行BLAST程序进行序列同源性比较，确定为昆虫的COI、Cytb、ITS2序列。利用GenBank中下载的36条同源序列，用ClustalX 1.83软件进行比对。用MEGA7.0分析碱基组成、变异位点，各种间序列差异，计算核苷酸组成。基于Kimura-2-Parameter模型，用NJ(Neighbour-Jioning)法构建分子系统树，采用自展法重复检测1 000次，循环估计系统树中节点的自举置信水平(bootstrap confidence level，BCL)。

2 结果与分析

2.1 采集标本所属类群的鉴定

研究表明，参照叶蝉科成虫的形态特征进行鉴定，观察外部形态，采集样品隶属于半翅目叶蝉科，分别为A：条沙叶蝉(Psammotettixconfinis)、B：广头叶蝉(Pediopsoides)、C：条沙叶蝉(Psammotettixconfinis)、D：大青叶蝉(Cicadellaviridis)、E：片角叶蝉(IdiocerusurakawensisMatsumura)、F：桃一点叶蝉(Singaporashinshana)、G：拟菱纹叶蝉(Hishimonoidesrecurvatis)。表3

表3 6种叶蝉样本成虫鉴定形态特征Table 3 Morphological characteristics for identification of 6 kinds of adult Cicadellidaes

2.2 叶蝉的ITS2、Cytb、COI 序列

研究表明，获得叶蝉核酸序列共19条， 其中COI基因6条、Cytb基因7条、ITS2基因6条，上述19条核酸序列中12条序列为研究首次获得。将所测序列进行拼接校对，在NCBI 网站上运行BLAST 程序，所测序列与昆虫的COI、Cytb、ITS2基因有很高的相似性，测定序列为COI、Cytb、ITS2基因序列。与 GeneBank中的相关基因序列进行比较，结合 GeneBank 中下载的与该COI、Cytb、ITS2序列一致性较高的叶蝉的序列，用 ClustalX1.83 软件进行比对，将非保守区域去除。

7个样品的Cytb序列AT含量分别为72%、73%、74%、74%、75%、73%、69%；6种样品COI序列的AT含量分别为70%、69%、69%、70%、66%、70%，COI、Cytb基因的AT含量高于GC，表现出A+T碱基偏嗜，且A与T含量相当，契合昆虫线粒体基因碱基组成特点。所得COI、Cytb基因序列均能在分子水平上进行监测分析。表4

2.3 叶蝉分子鉴定

研究表明，ITS1、ITS2相似度大于97%、Cytb,COI相似度大于98%视为相似度达到物种鉴定标准或水平[42]。研究获得7个COI基因序列中，有5个样品与GenBank中相关序列相似度高达99%，大于或等于鉴定水平98%，可以鉴定为该类昆虫，其中样品A、C与KR564712.1条沙叶蝉PsammotettixconfinisCOI基因的相似度分别为99.67%、99.49%，为条沙叶蝉；样品D与MF716879.1 大青叶蝉CicadellaviridisCOI基因的相似度为99.32%，为大青叶蝉；样品F与KJ867504.1桃一点叶蝉SingaporashinshanaCOI基因的相似度为99.68%，为桃一点叶蝉；样品G与KY364883.1拟菱纹叶蝉HishimonoidesrecurvatisCOI基因的相似度为99.38%，为拟菱纹叶蝉。样品D与GenBank中HQ456379.1 大青叶蝉CicadellaviridisCytb基因的相似度为99.54%，确定为大青叶蝉；样品F与NCBI中 KJ867509.1桃一点叶蝉SingaporashinshanaCytb基因的相似度为99.58%，为桃一点叶蝉；单个序列或多个序列的鉴定结果是一致的，每个样品都进行了准确鉴定，与形态鉴定结果一致，样品D与F 的Cytb基因序列进一步佐证了鉴定结果的准确性。样品B与E与数据库中相关条形码的相似度存在一定差距，未达到鉴定标准，不能确定其种类，需要通过其他基因序列进一步鉴定。表5

表4 mtDNA核苷酸组成统计Table 4 Nucleotide composition statistics

表5 叶蝉鉴定依据和鉴定结果 Table 5 Identification basis and identification results

2.4 叶蝉系统进化

研究表明，每个基因最高得分的最高相似度分别为：COI(99.68%)、Cytb(99.58%)、ITS2(95.92%)，结果显示均和叶蝉相关序列的相似性最高。研究选择了mtDNACOI、Cytb，核基因ITS2等3个基因片段研究叶蝉DNA 条形码，但因数据库中Cytb、ITS2基因序列数据较少，影响Cytb、ITS2相似度和遗传距离分析，故只阐述COI基因序列。构建COI叶蝉部分属种NJ分子系统树，研究样品的COI序列和叶蝉类昆虫相关序列分为5个进化支，且和已知叶蝉S.zeamais相关序列以较高置信值聚在一起，其中样品A、C与条沙叶蝉聚为1支，样品D与大青叶蝉聚为1支，样品F与桃一点叶蝉聚为1支，样品G与拟菱纹叶蝉聚为1支，将5种叶蝉准确区分开来。图1

注：图中数字表示置信度；样本用实心菱形标出Note:Integer indicates bootstrap confidence values, and sample is marked in solid diamond图1 与叶蝉相关的部分种类的 COI基因NJ 分子系统树Fig.1 COI gene NJ phylogenetic tree of partial species related to Cicadellidaes

3 讨 论

3.1 叶蝉DNA条形码基因碱基组成特征

研究7个样品的COI、Cytb序列A+T含量明显高于G+C，与田小娟对花蝽科昆虫的COI序列的研究结果一致，花蝽科序列T+ A含量为66.07%，存在 A/T 偏倚性，符合昆虫线粒体基因序列碱基组成特点[5]；与陈壮志等[43]对蜚蠊的Cytb序列的研究结果一致，蜚蠊A+T含量为69.5%，高于G+C含量，为典型的动物线粒体基因序列特征；章旭日等[44]研究福建小贯小绿叶蝉ITS序列发现，该类叶蝉ITS2 A+T占65.1%，碱基组成呈AT偏好性，与亲缘种的比较分析显示ITS2更适用于近缘种的分子鉴定[44]。相关研究表明，ITS2基因A+T含量占60%以上时，存在AT碱基偏嗜。研究中ITS2基因A+T含量未达到60%，与前人研究结果不一致，可能与ITS2更适用于近缘种的分子鉴定，该研究中叶蝉样品与数据亲缘关系较近有关；有研究表明，G+C含量与核苷酸替代率成反比[45]，研究中叶蝉ITS2 G+C含量较高，也可能与该区域核苷酸替代率较慢有关。但与李艳华[46]28S rDNA对桨角蚜小蜂和食蚧蚜小蜂的研究结果一致，两者G+C含量分别为60.3%、58.8%，均高于A+T的含量[46]，说明叶蝉rDNA基因较保守。Leo等用ITS2基因研究人体寄生虱序列时发现，ITS2不适合作为寄生虱的分子标记[47]，因此，仅由单一序列得到的结论可能存在片面性，物种的鉴定应该从形态、生境、分子生物学等方面综合分析[48]。

3.2 叶蝉DNA条形码基因的序列相似度

Cytb,COI相似度大于98%视为相似度达到物种鉴定标准或水平[42]。ITS1、ITS2 基因在NCBI中的相似度为 96%～97%，相似度相对较低，但也能有效鉴定物种[49]。对达到鉴定标准的鉴定到种，未达到标准的认定为新序列。单个样品COI、Cytb、ITS2序列均为单个同一样品获得，在COI获得鉴定结果时，其他序列虽未达到鉴定标准，也应为该叶蝉序列。Cytb、ITS2序列相似度低于鉴定水平，数据库中关于该种叶蝉的Cytb、ITS2序列不全面，研究获得的序列可作为新序列，例如样品ACOI(99.67%)=Cytb(79.75%)=ITS2(86.87%)，COI已获得鉴定，Cytb、ITS2序列作为样品A的序列，未达到鉴定要求，认定为样品A的新序列。同理，样品C获得Cytb、ITS2新序列各1条；样品F获得ITS2新序列1条；样品G获得ITS2、Cytb新序列各1条；样品B获得Cytb、ITS2新序列2条；样品E获得COI、Cytb、ITS2新序列3条。研究共获得新序列12条，Cytb、ITS2新序列较多，COI新序列较少，获得的新的序列有助于后续利用Cytb、ITS2序列快速鉴定，同时也说明Cytb、ITS2基因序列有待进一步补充完善。

3.3 叶蝉DNA条形码基因系统发育

从NJ分子系统树看出研究叶蝉样品COI序列分为5支，和已知的叶蝉S.zeamais相关序列以较高置信值聚在一起。样品A、C与条沙叶蝉亲缘关系较近，样品D与大青叶蝉有亲缘关系较近，样品F与桃一点叶蝉亲缘关系较近，样品G与弯茎拟菱纹叶蝉亲缘关系较近。A、C位于NJ树底端，与位于顶端的D亲缘关系最远，分别聚为1大支(D、F聚为1大支，G与A、C聚为1大支。)F与G位于NJ树中端，亲缘关系较近，但分别聚为一大支；D和F亲缘关系最近，聚为一大支，NJ树种间亲缘关系与形态分类结果一致。样品E与片角叶蝉亲缘关系较近，但NJ树置信度不高，可能受帕米尔高原区域生态环境、气候条件影响，与已知数据库中叶蝉种类分子结构有差异。

在叶蝉分子鉴定过程中，可能存在偏差，推测一方面是因帕米尔高原南麓地区生态环境、气候条件较特殊，区域内相关昆虫研究较少，导致GenBank数据库中叶蝉所属种的序列不全，没有足够的、丰富的数据进行物种条码比对[50]，相似度低；另一方面部分未经分类学家鉴定，而存在形态鉴定不准的序列可能被提交到Gen Bank中，造成分类地位可能不准确[51]，存在鉴定误差，在这种情况下，仅依靠DNA序列比对进行分子鉴定存在风险[52]。形态鉴定和分子鉴定相结合，才能提高速率，若研究对象是未知物种，需权威专家对该物种进行形态鉴定，对标本鉴定后获得的数据才会对物种的界定更有参考价值。关于形态鉴定，由于各种叶蝉成虫形态特征差异不显著，需从成虫的翅膀、颜色、触角、胫足、单复眼、生殖器等部位全面细致观察，若无成虫标本，则需捕捉成虫制成标本。

4 结 论

确定了mtDNACOI、Cytb及ITS2基因序列可作为叶蝉的DNA条形码，COI基因6条、Cytb基因7条、ITS2基因6条；其中1条COI序列，5条Cytb序列，6条ITS2序列。

通过mtDNA序列对比、遗传距离分析、系统发育树构建，得出叶蝉的mtDNA基因序列符合昆虫的mtDNA序列特征，确定了研究样品的种类，与形态鉴定吻合，获得的基因序列可作为叶蝉的DNA条形码，确定该区域4种叶蝉快速鉴定的DNA条形码。

对7份叶蝉样本进行了形态和分子鉴定，其中5分样本准确鉴定，帕米尔高原南麓有至少4种叶蝉存在。