高粱耐冷基因全基因组鉴定及进化分析

张国琴，葛玉彬，张正英

（甘肃省农业科学院作物研究所，甘肃 兰州 730070）

高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］是一种喜温C4作物，具有生物产量高、抗旱、耐涝、耐盐碱等特性，是干旱和半干旱地区重要的禾谷类作物。高粱春季播种后突遇低温时常常使种子在土壤中“粉种”或霉烂，导致萌发率、出苗率降低，出苗后植株长势较弱且生长缓慢，从而减少作物产量［1-2］。在高纬度温带地区，提早播期可延长高粱生长周期，增加生物产量，但早播遇到冷害的胁迫，种子不能发芽或者表现出较差的幼苗活力，限制高粱早期生长，降低生物量和产量，从而限制高粱在全球更多地区的推广利用［3-4］。

许多植物通过低温驯化增加耐冷性。关于在低温胁迫下参与低温调节和信号转导的基因功能及特性的报道颇多。植物通过调节各种基因的表达来适应低温胁迫，根据功能不同可将耐冷功能基因分为两大类。一类是功能性基因，即合成膜脂相改变的基因，如不饱和脂肪酸的基因、提高细胞膜流动性基因等；另一类基因则参与整个信号传导过程，在整个生理生化系统中起着调控作用，在模式作物拟南芥中转录因子CBF/DREB1蛋白家族和COR基因调控低温诱导基因的表达，从而增加植物的耐冷性［5-6］。已鉴定出一些直接调控CBF基因的转录因子，例如激活型转录因子螺旋结构转录因子（ICE1）和钙结合转录激活子（CAMTAs），以及抑制性型转录因子MYB15、EIN3和PIF3/4/7［7-9］；在水稻中已克隆的耐冷基因有Os－COLD1、OsSNAC2、OsDREB1B、OsqLTG3-1等［10-12］。我们通过NCBI、国家水稻数据中心等数据库，对模式作物拟南芥和水稻中的耐冷关键基因进行搜集，并在高粱基因组中进行同源性比较，旨在为高粱耐冷候选基因的挑取提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料数据来源

利用NCBI数据库、模式植物数据库（www.modelcrop.org）搜索已报道的拟南芥耐冷基因，从国家水稻数据中心数据库搜索水稻中已克隆耐冷基因和转录因子。登录高粱全基因组蛋白数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome），从该网站下载所需的DNA和蛋白质数据。

1.2 高粱耐冷基因的鉴定

利用pfam数据库（http://pfam.janelia.org/search/sequence）中的隐马尔可夫模型（HMM）拟南芥、水稻耐冷基因结构域的氨基酸序列与高粱全基因组蛋白数据库进行BLASTp序列比对，阈值小于等于1E-5，初步筛选出候选基因序列，得到候选序列后用Pfam 对结构域进行确认［13］。

1.3 创建高粱ARF基因家族进化树

利用MEGA6.0软件中的ClustalW，采用默认参数，对从高粱全基因组中搜索到的耐冷基因和模式作物耐冷基因蛋白的氨基酸序列进行多重比对，比对结果采用NJ（Neighbor-Joining）法构建系统进化树，Bootstrap校验值为1 000次。

2 结果与分析

2.1 模式作物耐冷基因的搜集

利用NCBI数据库、模式植物数据库（www.modelcrop.org）对已报道的拟南芥耐冷基因进搜索，结果如表1所示，搜集到的拟南芥主要耐冷基因有AtCBF1（AT4G25470）、AtCBF2（AT4G25480）、AtCBF3（AT4G25490）、AtICE1（AT1G12860）、 AtEIN3（AT3G20770）、AtAMP1（AT3G54720）等，分别编码C-端脱水效应结合因子蛋白、碱性螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白、乙烯不敏感蛋白、肽酶M28家族蛋白。从国家水稻数据中心数据库搜索水稻中主要耐冷基因，搜索到OsCOLD1（Os04g51180）、 OsSNAC2（Os04g0460600）、OsqLTG3-1（Os03g0103300）、Osctb1（Os04g 0619300）、OsDREB1B（Os09g0522000）、Os DREB1F（Os01g0968800）等，分别编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白、无顶端分生组织蛋白、未知蛋白、环氧氯丙烷相关蛋白、脱水效应元件结合蛋白。

2.2 高粱耐冷基因鉴定

通过BLASTp模式作物耐冷基因与高粱全基因组蛋白数据库进行搜索，通过Pfam对结构域进行确认，结果如表1所示。鉴定出高粱的AP2家族（CBF1、CBF2、CBF3、DREB1B、DREB1F）基因有 203个、ICE1基因有252个、EIN3基因有15个、SNAC2基因有133个、AMP1基因有3个、COLD1基因有3个、qLTG3-1基因有53个、ctb1基因有90个。从结果中得出高粱全基因组中耐冷转录因子基因的拷贝数除EIN3乙烯信号通路中转录因子拷贝数少（13个），其余的拷贝数较多（AP2家族203个、ICE1 252个、SNAC2 133个）；耐冷功能型基因拷贝数较少（COLD1 3个、qLTG3-1 53个、ctb1 90个、AMP1 3个），这有助于为高粱耐冷候选基因的筛选提供依据。

2.3 高粱耐冷基因的进化研究

将鉴定出的高粱耐冷基因与模式作物相关基因利用MEGA6.0软件构建系统进化树，统计结果如表2所示，高粱全基因组的EIN3基因家族被聚为五大类，其中XP 002463411.2、 XP 002467935.1、 XP 0213 17527.1与拟南芥中AtEIN3亲缘关系近，聚为一类，分布在高粱1号和2号染色体。高粱全基因组的AP2家族被聚为十五大类，其中XP 002457016.1、XP 021317625.1与拟南芥和水稻中AP2家族（AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、OsDREB1B、OsDREB1F）亲缘关系近，聚为一类，分布在高粱3号和5号染色体。高粱全基因组的ctb1基因家族被聚为十三大类，其中 XP 002447111.1、XP 0213 15473.1、XP 002447110.1、XP 021318475.1、XP 021318476.1与水稻Osctb1亲缘关系近，被聚为一类，分布在4号和6号染色体。高粱全基因组ICE家族被分为十大类，其中XP 002449576.1、XP 002459022.1与水稻中AtICE1亲缘关系近，聚为一类，分布在高粱3号和5号染色体。高粱全基因组中的LTG3-1基因被分为十三大类，其中XP021312137.1与水稻中OsqLTG3-1亲缘关系最近，聚为一类，分布在1号染色体。高粱全基因组中AMP1被分为2类，其中XP002466328.1与拟南芥AtAMP1亲缘关系最近，聚为一类，分布在1号染色体。高粱全基因组中COLD1基因被分为二类，其中XP021317902.1与OsCOLD1亲缘关系最近，聚为一类，分布在6号染色体。高粱全基因中SNAC2基因家族被分为十一大类，其中XP002446618.1、XP002452340.1、XP021314 112.1与OsSNAC2亲缘关系最近，聚为一类，分布在3号、4号和6号染色体。分析以上结果，高粱中的与模式作物耐冷基因亲缘关系近的耐冷基因主要分布在高粱1、2、3、4、5、6号染色体上，其中分布在1号和6号染色体上的最多，从而为找到高粱耐冷苗头基因提供依据。

表1 模式作物耐冷基因及在高粱全基因组中拷贝数

表2 高粱中与模式作物耐冷基因系统进化结果统计分析

3 小结和讨论

对已报道模式作物中部分耐冷基因及转录因子，通过对高粱全基因组进行扫描，得到高粱中的AP2（AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、OsDREB1B、OsDREB1F） 基因有203个，ICE1基因有252个，EIN3基因有15个，SNAC2基因有133个，AMP1基因有3个，COLD1基因有3个，qLTG3-1基因有53个，ctb1基因有90个。通过进化树分析，得出在高粱中XP 002457016.1和XP 021317625.1与模式作物AP2基因家族亲缘关系最近，分布在3号和5号染色体；XP 002463411.2、XP 002467935.1、XP 0213175 27.1与AtEIN3亲缘关系最近，分布在1号和2号染色体；XP 002447111.1、XP 0213154 73.1、XP 002447110.1、XP 021318475.1 和XP 021318476.1与Osctb1亲缘关系最近，分布在4号和6号染色体；XP 002449576.1和XP 002459022.1与Osctb1亲缘关系最近，分布在3号和5号染色体；XP021312137.1与OsqLTG3-1亲缘关系最近，分布在1号染色体；XP002466328.1与AtAMP1亲缘关系最近，分布在1号染色体；P021317902.1与OsCOLD1亲缘关系最近，分布在6号染色体；XP002446618.1、XP002452340.1、XP02 1314112.1与OsSNAC2亲缘关系最近，分布在3号、4号和6号染色体。

目前高粱耐冷研究主要涉及QTL初步定位。但已定位QTL效应值足够大的较少，还需要进一步研究验证这些QTL的效应，还不能直接用于高粱早期耐低温分子标记辅助选择育种［3-4，14-15］，有必要通过其他方法加快高粱耐冷性研究，例如RNA-seq等，近年来，RNA-seq技术广泛应用于植物应答低温胁迫，水稻中，通过RNA-seq对耐冷型水稻转录组分析鉴定出121个低温诱导基因，并且发现一个活性氧（ROS）-bZIP1调节子对早期低温胁迫响应起着重要作用［16］；利用RNA-seq技术对2个甜玉米自交系在低温胁迫进行转录组分析，分别鉴定出357和455差异表达基因，鉴定出与冷害响应共同差异表达基因94个，进一步分析发现74个差异表达转录因子，其中大多数参与新陈代谢和激素调节子［17］。我们对模式作物已报到的耐冷基因通过对高粱全基因组分析，得出在高粱全基因组中耐冷基因的苗头基因及大概所在染色体分布，从而为高粱耐冷快速研究方法（RNA-seq、GWAS等）分析得到差异表达基因获得目标耐冷候选基因提供依据。