2个枸杞品种的蛋白质提取与鉴定

张海燕，徐 炜，张立刚

（兰州新区现代农业发展研究院有限公司，甘肃 兰州 730300）

枸杞（Lycium barbarum）为茄科枸杞属，别名枸杞菜、红珠仔刺、牛右力、狗牙子、狗牙根、狗奶子，多分枝灌木，果实呈椭圆形或圆柱形，枸杞一般喜光照［1］。近年来，枸杞作为药食兼用的名贵资源已为国内外学者所瞩目，特别是国内许多学者对枸杞的化学成分、结构以及功能评价等方面进行了许多卓有成效的研究，并用现代医学理论和化学方法研究了枸杞的化学成分及功能因子，尤其对枸杞多糖的提取分离、化学分析、药理作用及临床应用已具有较广泛的研究基础［2-3］。研究较多的另一大类活性物质为类胡萝卜素，还有核黄素、维生素C、维生素B1、尼克酸、牛磺酸、17种氨基酸以及铜、铁、锌、锰、镁、硒、钙等多种微量元素，这些研究表明枸杞不仅营养丰富而且确实具有多方面的保健功能［4-5］。蛋白质是构成人体各组分的重要物质，枸杞中微量蛋白质也在枸杞功能中发挥着重要的作用，但与之相关的报道相对较少。宁杞1号为宁夏农林科学院从中宁农家品种大麻叶中采用单株选优方法选育而成［6］，是我国枸杞的主栽品种。蒙杞1号由内蒙古农牧科学院园艺研究所同内蒙古河套大学合作选育而成，有寸杞之称，和宁杞1号（地产）相比果实体积增大1倍以上，特优级果率增加73%，果肉厚度增大28%，果实千粒重增加 994.9 g［7］。

我们采用盐析、透析等方法，对蒙杞1号和宁杞1号中蛋白质进行提取，并利用蛋白质的SDS凝胶电泳技术测定2个枸杞中蛋白质的含量以及分析其电泳行为［8］，对枸杞中的蛋白质进行分析，以探索蛋白质含量与枸杞品质的关系，为枸杞品质鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试枸杞品种蒙杞1号由内蒙古农牧科学院园艺研究所提供，宁杞1号由宁夏农林科学院提供。

1.2 仪器设备

数显恒温水浴锅，营养果蔬破壁养生机，海尔电冰箱，电子天平，TGL-16M高速低温冷冻离心机（湘仪），超纯水系统，凝胶成像系统，SHZ-88水浴恒温振荡器，多功能电磁炉，电泳仪，电泳槽，格兰仕微波炉。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质的提取 将种子洗净晾干，称取蒙杞1号、宁杞1号各60 g，用破壁打浆机制浆，用纱布粗过滤，得到滤液。

1.3.2 盐析 盐析是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程，蛋白质在自然环境中通常是可溶的，其表面大部分是亲水基团，内部大部分是疏水基团。量取制浆后的枸杞液20 mL，分别根据体积计算出对应pH下的（NH4）2SO4量，如pH 6.0时，向其中加入（NH4）2SO4固体，使蛋白质溶液的（NH4）2SO4饱和度达40%，摇匀，再静置2～3 h后6 000 r/min离心20 min，倾出上清液并向其中继续加入（NH4）2SO4固体，使蛋白质溶液的饱和度达60%，摇匀，再静置2～3 h后以8 000 r/min离心20 min，倾出上清液并向其中继续加入（NH4）2SO4固体，使蛋白质溶液的饱和度达80%，摇匀，再静置2～3 h后以8 000 r/min离心20 min弃去上清液。向3次离心后倾出上清液的离心管中加入0.02 mol/L pH 6.0的PBS缓冲液5 mL，轻轻摇动，使贴于管壁上的蛋白质溶解后置冰箱中保存。用同样的方法对pH分别为7.0和8.0的枸杞蛋白提取液进行分级盐析，最后制得Ma1（6.0，40%）、Ma2（6.0，60%）、Ma3（6.0，80%）、Mb1（7.0，40%）、Mb2（7.0，60%）、Mb3（7.0，80%）、Mc1（8.0，40%）、Mc2（8.0，60%）、Mc3（8.0，80%）9个蒙杞 1号蛋白样液。用同样的方法得到Na1（6.0，40%）、Na2（6.0，60%）、Na3（6.0，80%）、Nb1（7.0，40%）、Nb2（7.0，60%）、Nb3（7.0，80%）、Nc1（8.0，40%）、Nc2（8.0，60%）、Nc3（8.0，80%）9个宁杞1号蛋白质样液。

1.3.3 透析 将2种蛋白质提取液分别装入透析袋中，置于对应pH的0.02 mol/L PBS缓冲液中进行透析，每隔6～8 h换PBS缓冲液1次，连续透析64 h。

1.3.4 浓缩 将装有蛋白质样液的透析袋置于盛有聚乙二醇的培养皿中浓缩，直到蛋白质样液体积为1 mL左右为止。

1.3.5 蛋白质的鉴定 将枸杞蛋白质与样品缓冲液按体积比1∶1混合，加热煮沸3 min，10 000 r/min离心，分离胶和浓缩胶的制备方法见表1［10］，然后进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）［9］、染色和脱色Ⅳ［11］，最后照相。

表1 分离胶和浓缩胶的制备方法

2 结果与分析

2.1 蒙杞1号电泳后条带分布情况

由蒙杞1号蛋白质电泳图谱（图1）中条带的宽度和颜色深度不一可知，每种蛋白的含量不同。在相同pH条件下，（NH4）2SO4浓度为40%时条带颜色最深，（NH4）2SO4浓度为60%、80%时依次降低，（NH4）2SO4浓度为80%时几乎没有条带。在相同（NH4）2SO4浓度下，pH为8时蛋白质条带颜色最深。且每个泳道蛋白质条带数不同，说明在不同条件下枸杞中蛋白质含量不同。

2.2 宁杞1号电泳后条带分布情况

由图2条带的宽度和颜色的深浅不一可知，每种蛋白的含量不同。在相同pH下，（NH4）2SO4浓度为60%时蛋白质条带颜色最深，（NH4）2SO4浓度为80%时几乎没有蛋白质条带。在相同（NH4）2SO4浓度下，pH为6时蛋白质条带最多；pH为7、8时蛋白质含量依次降低；pH为8时几乎没有蛋白质条带。

2.3 2个品种电泳后分析

蒙杞1号在Na1（6.0，40%）的条件下，有蛋白质亚基7种；而宁杞1号在Na1（6.0，40%）即相同条件下，蛋白质亚基数为5。其余在相同条件下，除（NH4）2SO4浓度为80%外，蒙杞1号中蛋白质亚基数多于宁杞1号中蛋白质的亚基数。蒙杞1号在Ma1（6.0，40%）和 Mc2（8.0，60%）条件下蛋白质亚基数均为7，pH为8时蛋白质亚基数为0；宁杞 1 号在 Na1（6.0，40%）和Nb1（7.0，40%）条件下，蛋白质亚基数均为5，pH为8时蛋白质亚基数也为0。

3 结论

研究结果表明，枸杞中存在一定量的蛋白质。蒙杞1号中的蛋白质亚基多于宁杞1号。相同硫酸铵浓度，不同pH下，蛋白质亚基数不同。蒙杞1号在pH 6.0时蛋白质亚基数最多，即含量最多；pH 7.0、8.0时蛋白质亚基数依次减少，其中pH 8.0时几乎没有蛋白质，亚基数为0。宁杞1号在pH 7.0时蛋白质亚基数最多，蛋白质含量最多；pH 6.0时亚基数减少，蛋白质含量降低；pH 8.0时几乎没有蛋白质。在相同pH、不同硫酸铵浓度下，亚基数不同，即蛋白质含量不同。蒙杞1号在硫酸铵盐浓度为40%时亚基数最多，蛋白质含量最多；硫酸铵盐浓度为80%时蛋白质含量最少，亚基数为0。宁杞1号在硫酸铵盐浓度为80%时蛋白质含量最少，几乎没有蛋白质；浓度在60%时相对较多，40%时亚基数最多，蛋白质含量最高。综上可知，蒙杞1号在pH 6.0、硫酸铵盐浓度为40%时提取效果最好，宁杞1号在pH 7.0、硫酸铵盐浓度为60%时提取效果最佳。