基于网络药理学方法探究中药肉桂治疗糖尿病的作用机制

王珺，苏本正，蒋海强，孙雨，杨钰涵，崔宁，于宗渊*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

糖尿病是一种临床常见的、多发的、因体内胰岛素分泌相对或绝对不足引起的代谢紊乱性疾病[1]。随着人们生活水平的提高，饮食结构和习惯不断改变，糖尿病发病率也随之持续增长[2]。糖尿病病因和发病机制复杂，目前临床上暂无特效、稳定的治疗与预防方法[3]，通常通过药物、饮食疗法、运动疗法等综合治疗手段控制患者的血糖水平。双胍类降糖药是糖尿病治疗中常用的口服降糖药，其降糖效果较好，但长期使用仍会出现血糖过低、过敏等不良反应[4-5]。近年来，中医药在治疗糖尿病方面取得了可喜的疗效，中草药的治疗效果温和而安全，已成为治疗糖尿病的普遍选择。

肉桂为樟科樟属植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥树皮[6]，是传统中药，具有补火助阳、引火归元、散寒止痛、温通经脉的功效[7]。现代药理学研究表明，肉桂具有抗癌、抗炎镇痛、抗菌、降血糖、心血管保护、细胞保护、神经保护、免疫调节等多种生物活性[8]。研究发现，肉桂在治疗糖尿病方面有很好的疗效，可降低血糖、血脂[9-10]，具有明显改善胰岛素抵抗的作用，然而，对于肉桂在糖尿病治疗中的药效成分和作用机制仍缺乏全面了解。近年来，生物信息学技术迅猛发展，网络药理学方法逐渐成为系统揭示中药分子机制的重要手段。网络药理学将药物和靶点抽象成网络模型，从网络层面上系统、全面地揭示药物作用机制[11-12]。因此，本研究旨在借助网络药理学方法和分子对接技术，探索肉桂的药效成分、作用靶点和信号通路之间的网络关系，阐明其治疗糖尿病的生物学机制，为肉桂治疗糖尿病的临床用药提供科学依据及新的思路。

1 材料与方法

1.1 肉桂有效成分与靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine system pharmacology datebase and analysis platform，TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/)中，设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，检索并筛选肉桂的化学成分信息[13]。活性成分的靶点蛋白信息从TCMSP数据库中获取，再利用UniProt数据库(http://tcmspw.com/index.php)校正靶点蛋白为规范的基因名称，删除无靶点成分，整理得肉桂的有效成分及对应靶点数据信息。

1.2 疾病靶点筛选

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中以“糖尿病(diabetes)”为关键词，检索已报道的与糖尿病相关靶点的信息。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将1.1项下的成分靶点与1.2项下的疾病靶点进行映射，以获得肉桂治疗糖尿病的潜在靶点。为了更好地分析靶点蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)，借助STRING Version 11.0 数据库(https://string-db.org/)构建潜在靶点的PPI网络，限定物种为人(Homo sapiens)，去除孤立靶点。再将PPI网络图导入Cytoscape 3.6.1软件进行拓扑属性分析，分析网络图中的关键节点及度值，得到核心靶点。

1.4 GO和KEGG富集分析

为说明肉桂治疗糖尿病有效成分的核心作用靶点在基因功能和信号通路中的作用，本研究采用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)Version 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析，利用STRING数据库进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，通过基因的富集分析预测肉桂治疗糖尿病的可能机制。

1.5 成分与靶点对接

采用AutoDock vina软件对核心靶点中度值(degree)排名前五的靶点蛋白与肉桂中的关键成分进行分子对接验证，并用传统治疗药物二甲双胍作对照分析。通过ZINC数据库(https://zinc.docking.org/)获取中药小分子配体的3D结构，全部保存为mol2格式。从RCSB PDB结构数据库(www.rcsb.org/)中获得靶点蛋白和二甲双胍的三维结构，用PyMOL 1.7软件去除受体蛋白中的溶剂。利用AutoDock Tools软件为受体和配体加氢、计算电荷并赋予原子类型，再运用Autodockvina软件在Windows 10环境下批量对接，得到结合能，用PyMOL 1.7软件对对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 肉桂主要活性成分及靶点筛选

根据TCMSP数据库及文献查找收集筛选后，共获得肉桂的有效成分32个，对应靶点244个，具体信息见表1。在GeneCards数据库中检索得到糖尿病相关靶点1592个。二者映射后得到交集基因131个。将筛选出的32个有效成分及131个交集基因导入Cytoscape 3.6.1软件，构建成分-靶点网络图(图1)。该网络包含163个节点和240条边，六边形代表肉桂成分，菱形代表靶点蛋白。分析各化学成分的度值，得到肉桂中度值排名前十的关键成分，包括槲皮素、油酸、丁香酚、萜基烯、异丁香酚甲醚、肉桂醛、邻苯二甲酸二异丁酯、茴香烯、原花青素B1和4-羟基-4-甲基-2-戊酮。其中，槲皮素的度值最大，说明其在有效成分和靶点中起到关键作用。

表1 肉桂活性成分筛选结果

图1 肉桂成分-靶点网络

2.2 靶点PPI网络分析

图2表示肉桂治疗糖尿病的潜在靶点的PPI网络。该网络中共包含130个节点和2437条边。节点越大，则靶点蛋白的度值越大[14]。节点颜色由蓝色变为橙色代表靶点蛋白的度值由大变小。节点根据网络拓扑学参数，以度值≥69、介数(betweenness)≥67.956为筛选条件，共得到20个核心靶点蛋白CCL2、INS、PPARG、IL6、JUN、FOS、TNF、IL1B、CASP3、VEGFA、EGFR、EGF、CAT、AKT1、CXCL8、NOS3、PTGS2、TP53、MMP9、MAPK1(图3和表2)，提示这些蛋白在肉桂抗糖尿病机制中发挥关键作用。

图2 潜在靶点PPI网络

图3 核心靶点网络

表2 核心靶点信息

2.3 GO和KEGG富集分析结果

利用DAVAID 6.8平台对肉桂治疗糖尿病的核心靶点进行GO富集分析，根据P值得到GO条目45条(P<0.05)，其中生物过程32条，主要涉及RNA聚合酶II启动子对转录的正调控、凋亡过程的负调控、炎症反应、内皮细胞增殖的正调控、细胞生长的正调控等方面；细胞组成相关条目4条，主要涉及胞外间隙和转录因子复合体等方面；分子功能相关条目9条，主要涉及一氧化氮合酶调节因子活性、染色质结合、转录调节区DNA结合等方面。选取生物过程中P值较高的前20个条目以及细胞组成和分子功能条目进行可视化(图4)。

图4 肉桂治疗糖尿病的GO富集分析

利用STRING数据库对20个核心靶点进行通路富集分析(P<0.05)。根据KEGG通路富集分析结果(图5)，预测肉桂主要通过糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、癌症通路和MAPK信号通路等途径治疗糖尿病(表3，详细信息见OSID)。

表3 肉桂治疗糖尿病的KEGG信号通路

图5 肉桂治疗糖尿病的KEGG信号通路分析

2.4 分子对接结果

将PPI网络中度值排名前5的靶点蛋白(INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA)分别与二甲双胍和10个关键成分进行分子对接验证(表4)。结果显示，10个关键成分与5个靶点蛋白的结合能均良好，并且肉桂中部分活性成分与靶点对接的结合能明显低于阳性药。其中，原花青素B1与INS、原花青素B1与IL6、槲皮素与TNF、槲皮素与IL6、原花青素B1与VEGFA的结合能较小，分子结合构象稳定(图6)。结合上述结果，肉桂成分与核心靶点均具有良好的结合活性，表明肉桂可能通过作用于关键靶点而对糖尿病发挥治疗作用。

表4 成分与靶点的对接结果

图6 蛋白-配体对接模拟

3 讨论

中医学称糖尿病为“消渴”，其病机主要为阴虚燥热、气阴两虚、阴损及阳、阴阳两虚[15]。中医临床上常用肉桂治疗糖尿病的阴阳两虚阶段，尤其是阳虚阶段[10]。有研究发现，肉桂能调节2型糖尿病患者的空腹血糖水平[16]，还能增加GLP-1(肠升糖素样肽1)的分泌，抑制葡萄糖苷酶的活性，促进GLUT-4(葡萄糖转运蛋白4)的表达[17]。此外，肉桂中的多酚类物质还可以增加胰岛素含量，改善胰岛素敏感性[18]。由此可见，肉桂在治疗糖尿病方面具有一定功效。

本研究利用网络药理学数据库对肉桂的主要有效成分进行了研究，以OB≥30%作为筛选标准，共筛选出32个活性化合物，作用于131个糖尿病靶点。其中，槲皮素、油酸、丁香酚、萜基烯、异丁香酚甲醚、肉桂醛、邻苯二甲酸二异丁酯、茴香烯、原花青素B1和4-羟基-4-甲基-2-戊酮等10种成分的度值较高，提示这些成分可能是肉桂治疗糖尿病的重要成分，值得进一步研究。槲皮素的度值远高于其他成分，预测是肉桂中发挥药效的主要物质。槲皮素是典型的黄酮类化合物，具有多种生理活性，包括抗癌、抗氧化、抗纤维化、抗炎、抗菌、抗衰老、抗抑郁症、抗白血病、抗糖尿病等多种生物活性[19]。现有研究发现，槲皮素能够减轻高糖诱导的大鼠氧化应激指标，降低血糖，减轻大鼠外周胰岛素抵抗，治疗效果与二甲双胍一致[20]。油酸可以直接刺激胰脏分泌胰岛素，且会加强葡萄糖刺激胰岛素分泌的作用。肉桂醛可以增加脂肪和骨骼肌组织对葡萄糖的摄取，促进肝脏糖原合成，改善胰岛素敏感性，维持糖尿病动物的血糖和血脂稳态[21]。原花青素能促进肝糖原储存以及胰岛素抵抗细胞内的葡萄糖消耗[22]。在本研究中，槲皮素、油酸、肉桂醛、原花青素等成分能调节大多数糖尿病的靶点，说明这些成分可能是治疗糖尿病的代表性化合物，此外，通过网络分析发现它们还共同作用于前列腺素G/H合酶2(PTGS2)靶点，胰腺β细胞中PTGS2的表达与胰岛素的表达密切相关，抑制PTGS2可剂量依赖性地促进胰岛素的分泌，调节血糖[23]。以上研究表明，肉桂治疗糖尿病具有多成分协同作用的特点。

肉桂与糖尿病的交集靶点共131个，说明肉桂是通过多靶点协同起到治疗糖尿病的作用。INS(胰岛素)是血糖浓度的主要调节因子，可以阻断糖原分解和糖异生，刺激脂肪生成、糖原和蛋白质合成，增加肌肉和脂肪对葡萄糖的摄取，从而起到降低血糖浓度的作用[24]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是胰岛素信号通路下游的重要靶点，具有抑制细胞凋亡和调节代谢的作用，能够阻止胰岛素受体去磷酸化，调节葡萄糖转运环节[25-27]。IL-6和TNF是具有多种功能的细胞因子，可直接损伤胰岛β细胞，诱发胰岛素抵抗。TNF可通过抑制胰岛素信号的传递, 进而导致胰岛素抵抗[28]。在PPI网络中, INS、AKT1、IL6、TNF和VEGFA的度值最高，说明它们在治疗糖尿病过程中起到重要作用。这些结果与网络药理学及分子对接结果共同表明，INS、AKT1、IL6、TNF和VEGFA等靶点可能是肉桂抗糖尿病活性的关键靶点，也提示使用网络药理学预测靶点具有一定的科学性与准确性。

此外，本文还对肉桂治疗糖尿病的核心靶点进行了KEGG通路富集分析，结果显示，这些靶点作用于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、癌症通路和MAPK信号通路等，这些通路之间相互影响，介导疾病的炎症反应、信号转导等过程，为肉桂治疗糖尿病的主要通路。MAPK可通过磷酸化靶蛋白来调控信号通路，促进能量代谢[29]；还可通过上调GLUT-4的表达，促进葡萄糖的吸收和利用，增强胰岛素受体的敏感性，从而改善胰岛素抵抗[30]。另有研究发现，肉桂醛能够促进分泌血管内皮细胞生长因子(VEGFA)，这与MAPK信号通路活性上调相关[31]。

综上所述，本研究基于网络药理学方法和分子对接技术对中药肉桂所含的药效成分、靶点及作用途径进行研究，发现肉桂能够通过多成分、多靶点、多种生物途径及多条通路达到治疗糖尿病的目的，为肉桂临床治疗糖尿病提供了理论基础。