痛风患者NLRP3基因多态性观察

李瑞，苗蕾，陈邬锦，冀琨，张蓓，孙玉萍

1 新疆医科大学基础医学院，新疆乌鲁木齐830011；2 新疆医科大学公共卫生学院；3新疆医科大学第六附属医院

痛风(Gout)是由于尿酸盐(monosodium urate，MSU)晶体沉积于关节及周围软组织引起的以局部红、肿、热、痛为主要临床表现的自限性炎症性关节炎[1]。痛风急性发作时患者受累关节呈刀割样疼痛，导致关节功能受限，严重影响患者的生活质量。近年来高嘌呤膳食模式及生活习惯的不断改变，导致痛风的发病率呈逐年增高趋势[2]。目前全球痛风发病率0.1%～10%，而我国痛风发病率约为2%[3]。目前，关于痛风发病机制的相关研究不断增多，但确切发病机制尚不完全清楚。痛风的急性发作受遗传因素和环境因素的共同影响，而遗传因素在痛风的急性发作过程中占主要作用。研究[4-5]发现，三磷酸腺苷结合家族G2(ABCG2)、蛋白激酶D2 (PKD2)、葡萄糖易化转运蛋白9(SLC2A9)、钾电压门控通道Q亚家族成员1(KCNQ1)、溶质载体家族22成员12(SLC22A12)、磷酸钠运输蛋白1(SLC17A1)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)等基因的多态性与痛风的易感性间存在相关性。作为内源性危险信号分子的MSU晶体能有效激活Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路，产生并释放促炎细胞因子白细胞介素1(IL-1)、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，通过级联放大效应启动炎症应答，引起痛风的急性发作[6]。2013年1月～2019年6月,我们聚焦尿酸盐晶体激活NOD样受体信号通路引起痛风急性发作这一致病机制，选取NLRP3基因作为目标基因，通过分子生物学方法检测痛风患者目标基因多态性，旨在探索NLRP3基因多态性与痛风易感性的关系，为探索痛风遗传因素及痛风的诊断及治疗方法提供实验室数据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院同期收治的痛风患者267例及健康者448例，均为男性汉族。痛风的诊断符合2015年美国风湿病学会制定的痛风诊断标准[7]。纳入者年龄20～70岁，且相互间没有血缘关系。排除标准：排除患有恶性肿瘤、血液系统疾病、肝肾疾病、自身免疫性疾病者，排除近期服用促进或降低尿酸排泄药物者。本研究获得新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会审批，纳入者知情同意。两组年龄具有可比性，体质量指数(BMI)、收缩压(DBP)、血尿酸(SUA)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平在两组间具有统计学差异(P均<0.05)，且除了HDL-C外，其他指标均表现为痛风患者高于健康者。

1.2 痛风患者及健康者血清NLRP3基因检测及分型 收集痛风患者及健康者禁食12 h晨起空腹静脉血液5 mL,3 500 r/min分离血清，-80 ℃保存备用。依据在国际人类基因组单体型图计划(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)中显示的SNP信息，选取NLRP3基因rs7525979、rs3806268 和rs10754558三个多态性位点为目标位点。选用基因组DNA提取试剂盒，按操作说明提取外周静脉血液标本中的基因组DNA，用经过Primer 3软件设计的引物进行PCR(polymerase chain reaction)反应，最后用探针法对目标位点进行基因分型。NLRP3基因单核苷酸多态性位点的连接产物序列如下：rs7525979上游引物为5′-CACTTCCAGTTTTTGCCGGG-3′,下游引物为5′-GGGAATGGCTGGTGCTCAAT-3′；rs3806268上游引物为5′-GCTGTTTGACCCCGATGATGAG-3′,下游引物为5′-CCCCAGGCTCCTCTGTGTCA-3′；rs10754558上游引物为5′-CTTTACGCCAGGGTGAGGAAGAC-3′,下游引物为5′-AGCGGGAATGATGATATGAGCA-3′。

1.3 资料收集方法 选用统一的问卷收集研究对象的一般健康资料，包括姓名、性别、年龄、民族、现病史、既往史、家族遗传史、服药史、身高、体质量、收缩压、舒张压等。选用新疆医科大学第一附属医院检验科日立7060全自动生化分析仪测定纳入者SUA、TG、TC、BUN、GLU、CREA、HDL-C和LDL-C等一般生化指标。

2 结果

2.1 痛风患者及健康者NLRP3基因rs7525979、rs3806268及rs10754558位点基因型和等位基因频率比较 痛风患者NLRP3基因rs7525979位点基因型CC、CT、TT分别为177、81、9例，等位基因C、T频率分别为81.5%(435/534)、18.5%(99/534)；健康者分别为289、146、13例，等位基因频率分别为80.8%(724/896)、19.2%(172/896)。痛风患者NLRP3基因rs3806268位点基因型GG、GA、AA分别为59、118、90例，等位基因G、A频率分别为44.2%(236/534)、55.8%(298/534)；健康者分别为104、238、106例，等位基因频率分别为49.8%(446/896)、50.2%(450/896)。痛风患者NLRP3基因rs10754558位点基因型GG、GC、CC分别为48、135、84例，等位基因G、C频率分别为43.3%(231/534)、56.7%(303/534)；健康者分别为95、234、119例，等位基因频率分别为47.3%(424/896)、52.7%(472/896)。痛风患者及健康者NLRP3基因rs3806268位点基因型和等位基因分布具有统计学意义差异(P均<0.05)。

2.2 NLRP3基因rs7525979、rs3806268及rs10754558位点基因型与痛风易感性的相关性 加性模型分析结果表明，与GG基因型比较，NLRP3基因rs3806268位点AA基因型为痛风的保护因素(OR为0.58,95%CI:0.41～0.84)；隐性模型分析结果表明，与GG+GA基因型比较，AA基因型为痛风的的保护因素(OR为0.61,95%CI:0.44～0.85)。rs7525979和rs10754558位点在不同遗传模型中未见与痛风存在相关性(95%CI横跨1)。

3 讨论

痛风是目前我国的第二大代谢性疾病，其急性发作与多因素密切相关。研究表明，男性痛风的发生率高于女性，但女性随着年龄的升高，体内激素水平的不断变化，使得女性痛风的发生率也逐渐增高[8]。高嘌呤饮食如摄入过多海产品、动物内脏等或饮酒均能增加痛风的发病率[9]。痛风具有家族遗传性的特点且其发生与肥胖、高血压、糖尿病、肾脏疾病、心脑血管疾病等密切相关[10-13]。本研究结果显示，BMI、DBP、SUA、GLU、BUN、CREA、TG、HDL-C 和LDL-C水平在痛风组和健康对照组间差异具有统计学意义。

MSU晶体通过被模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PRR)识别可启动机体先天性免疫应答和炎症反应，而位于细胞膜上的Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)和位于细胞质中的NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)是机体内两大类重要的PRR。研究表明，NLR可与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱天冬氨酸酶(caspase-1)一起形成炎性体，参与调控多种疾病，如痛风、糖尿病、肾脏疾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、肠炎、口腔疾病等[14-15]。NLRP3(NLR family，pyrin domain containing 3)属于NOD样家族成员，可通过其富含亮氨酸重复序列的羧基端(leucine rich repeat，LRR)识别MSU晶体并与之结合，通过自身寡聚化，活化相关受体。此时位于NLRP3氨基端的热蛋白结构域(PYD)即可与ASC羧基端的PYD结构域结合，招募ASC。再通过ASC氨基端的CARD结构域与caspase-1前体的CARD结构域结合，活化caspase-1。活化的caspase-1能加工并分泌成熟的IL-1β、IL-18等促炎细胞因子，而成熟的IL-1β能够通过活化T细胞从而激活NF-KB或MAPK信号通路，启动先天性免疫应答和炎症反应，引起痛风的急性发作[16]。

NLRP3基因多态性与疾病易感性间关系的研究已经开展。LEE等[17]的荟萃分析结果表明NLRP3基因rs10754558位点基因突变与自身免疫和炎症性疾病间无相关性，但WU等[18]的研究结果则发现rs3806268位点多态性与女性非结核性肺部疾病间存在相关性；张鲲等[19-20]的研究发现,rs10754558位点突变与下肢动脉硬化闭塞症遗传易感性间存在相关性，且GG基因型为该疾病的危险因素。本研究结果发现，NLRP3基因rs3806268位点基因型和等位基因在痛风组和对照组间分布具有有统计学意义的差异,且该位点AA基因型为痛风的保护性因素，能降低痛风的发病风险。NLRP3炎性信号通路可能参与了痛风炎症的发病，NLRP3能够通过活化IL-1β炎性因子，调控机体炎性反应，随着分子生物学技术的不断发展，NLRP3基因多态性与痛风易感性研究深入开展将为痛风治疗药物的研制及防止痛风发作提供新靶点。

综上所述，NLRP3基因rs3806268位点基因多态性与痛风易感性间存在相关性，rs3806268位点突变可能是痛风的保护性因素。但本研究依然存在一些局限性，如本研究为病例对照研究，样本含量还不十分充足且研究对象来源于同一地方的同一医院，可能存在选择偏倚，结果不能得以广泛推广。因此为更好的探索痛风发病的遗传因素，今后大样本、前瞻性研究的开展是必不可少的。