牦牛解没食子酸链球菌的分离鉴定及药敏试验

张朝辉，冉艾，岳华*

（1.四川省甘孜藏族自治州动物疫病预防控制中心，四川 康定 626000；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

本研究对四川省甘孜藏族自治州某地的发病牦牛进行病原菌分离鉴定和药敏试验，旨在为临床防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本 四川甘孜州某地的天然放牧牦牛于2018年7月中旬开始发病，至7月底有20多头死亡。主要临床表现：精神沉郁，采食量下降，腹泻，呼吸困难，后期卧地不起等。剖检病死牦牛可见腹腔有大量淡黄色积水，肝脏肿大出血、实变，脾脏、肺脏肿大，淋巴结肿大有出血点。无菌采集病死牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏等组织，用于细菌的分离鉴定。

1.2 实验动物 6～8 周龄雌性昆明小白鼠20只，体重20±2 g，购自四川达硕实验动物中心。

1.3 试验用品 绵羊血琼脂平板、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、生化鉴定试剂均购自青岛海博生物技术有限公司；马血清购自郑州佰安生物工程有限公司；rTaq DNA 聚合酶、PCR 试剂、DNA Marker 等均购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；药敏试验质控菌株（大肠杆菌ATCC25922）由西南民族大学实验室提供；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 细菌的分离培养 将无菌采集的心脏、肝脏、脾脏及肺脏组织接种于绵羊血琼脂平板，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，观察菌落形态，挑取单个溶血菌落于含5%马血清的TSA 培养基上进行纯化培养。对纯化后的菌落进行革兰氏染色镜检，并接种于含5%马血清的TSB 培养基中，在37 ℃恒温条件进行增菌培养（160 r/min摇床培养）。

1.5 分离菌株的生化鉴定 参照文献［1］报道的方法，将4 株分离菌的增菌液分别取100 μL 接种于氧化酶、果糖、尿素、枸橼酸盐、靛基质、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、乳糖生化培养基内，于37℃培养24h，观察其主要生化特性。

1.6 分离菌株16S rRNA基因序列的扩增 运用酚-氯仿法提取分离株的DNA。采用文献［1］报道的扩增细菌16S rRNA的通用引物进行PCR扩增，引物序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，扩增长度约为1 500 bp。25 μL PCR反应体系：PCR-MIX 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，样品2 μL，上下游引物各1 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃30 s，72 ℃45 s，35 个循环；72 ℃10 min。PCR 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的基因片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 16S rRNA 基因序列的遗传进化分析 在NCBI 上用BLAST 将测序获得的解没食子酸链球菌解没食子酸亚种16S rRNA 基因序列同GenBank数据库中收录的解没食子酸链球菌解没食子酸亚种序列进行同源性比对，并从GenBank中下载不同国家、不同宿主、不同时间且同源性高的解没食子酸链球菌解没食子酸亚种10条，运用Mega 6.0软件构建系统发育树。

1.8 对小鼠的致病性 将小鼠随机分为5 组（4组试验组，1 组对照组），每组4 只。将4 株解没食子酸链球菌解没食子酸亚种分别接种于含5%马血清的TSB增菌液中，于37 ℃恒温条件下振荡（160r/min）培养24h后，取6mL菌液12000r/min离心10min，弃上清，用TSB增菌液调整菌液浓度至1×109CFU/mL，试验组以0.3 mL/只颈背部皮下注射，对照组注射等量的TSB培养基。观察小鼠的临床症状，若有发病小鼠，剖检观察小鼠的病理变化。

1.9 药敏试验 按照WHO推荐的K-B纸片法进行药敏试验。挑取纯化的单菌落接种于含5%马血清的TSB 培养基中，37 ℃培养24 h。用TSB培养基稀释菌液至终浓度为1.5×108CFU/mL。用灭菌棉拭子均匀涂布在TSA平板上，待菌液吸收后贴药敏纸片，37 ℃恒温培养24～48 h。药敏结果按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2009年标准判定，以耐药和敏感记录结果。

2 结果

2.1 细菌的分离培养 将病料接种于绵羊血琼脂平板上，经37 ℃、5% CO2培养24 h 后，可见灰白色、湿润、凸起的细小菌落，周围有草绿色溶血环；溶血单菌落转接于含5%马血清的TSA 培养基上经37 ℃培养24 h 后，可见光滑、半透明的菌落；革兰氏染色镜检为G+球菌。

2.2 分离菌株的生化特征 4 株分离菌的生理生化特性与解没食子酸链球菌解没食子酸亚种的基本一致（见表1），初步判定本次分离的病原为解没食子酸链球菌解没食子酸亚种。

表1 分离菌株的生理生化特性

2.3 分离菌株16S rRNA 基因序列的扩增 从4株分离菌的基因组DNA中扩增出了长约1 500 bp的特异性条带（见图1），而阴性对照无扩增条带，与预期目的片段相符；通过与NCBI 上GenBank 网络数据库进行比对，结果与S.gallolyticus subsp.Gallolyticus（GenBank 登录号：EU163484.1）的同源性为99%，进一步证实4株分离菌为解没食子酸链球菌解没食子酸亚种。

图1 分离菌株16S rRNA基因序列的扩增结果

2.4 基于16S rRNA 基因序列的遗传进化分析 将4 株分离菌株的16S rRNA 基因序列与不同国家、不同宿主、不同时间且同源性高的解没食子酸链球菌解没食子酸亚种16S rRNA 序列进行系统发育分析（图2），结果显示：4 株分离菌与近年中国株、日本株、德国株和美国株共9株聚为一支，另外一株日本株单独聚为一支。

图2 解没食子酸链球菌解没食子酸亚种16S rRNA基因的遗传进化树

2.5 对小鼠的致病性 试验组小白鼠在攻毒后6 h 左右均出现行动减少，反应迟钝，精神萎靡不振，弓腰、竖毛、颤抖，摄食量明显减少，蜷缩一隅等临床症状，12 h 后出现轻度的腹泻症状。剖检见小鼠肠壁变薄，肠内有黄色黏液，其余组织或器官未见肉眼可见的病变。结果表明，4 株分离菌对小鼠具有致病性。

2.6 药敏试验结果 应用临床常用的13种抗菌类药物进行药物敏感性试验，结果显示:4 株分离菌均对万古霉素、罗红霉素、红霉素、左氧氟沙星、头孢噻肟、利福平、林可霉素、替考拉宁10 种药物敏感，对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、甲氧苄胺嘧啶、四环素5种药物耐药。

3 讨论

牛链球菌是一类人兽共患病原菌，包括7 个不同的种和亚种，常引起人和多种动物的腹泻、心内膜炎、脑膜炎、结肠癌等疾病，解没食子酸链球菌解没食子酸亚种属于其中之一［2-5］。西班牙Corredoira J等［6］从三家医院收集的596份病例中检测出257 份解没食子酸链球菌解没食子酸亚种，均与直肠癌相关。也有研究结果表明，24%的链球菌感染性心内膜炎都是由解没食子酸链球菌解没食子酸亚种引起的［7］。目前，国内有朱聪智等［1］和杨崇勤等［8］从患者血液及骨髓中分离出解没食子酸链球菌解没食子酸亚种的报道，本试验是国内首次在发病牦牛体内检测到该病原菌，其公共卫生意义值得进一步研究。

抗菌药物是治疗细菌病的主要措施，但是近年来关于该菌耐药的报道越来越多。本次药敏试验表明，分离菌株对万古霉素、罗红霉素、红霉素、左氧氟沙星等敏感，对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、甲氧苄胺嘧啶等耐药，这一结果为当地治疗药物的选择提供了参考。