猪伪狂犬病最新研究进展

向 敏，夏 瑜，王定发，邵志勇，李中心，阮 征，张四化，刘开武，万学济，李新玉，史永梅，程 蕾

（1.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430208；2.武汉市动物疫病预防控制中心，武汉 430016；3.邓州市动物卫生监督所，河南 邓州 474150）

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）感染是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种多种动物共患的、急性接触性传染病。虽然在一些使用gE-deleted 疫苗的国家商业猪群中已经根除了这种疾病，但在许多国家尤其是在猪群密集的地区，PR仍然是猪最重要的疾病之一。PR 能够与猪细小病毒病、猪蓝耳病、猪圆环病毒Ⅱ型病及迟发型猪瘟病造成共感染或者混合感染，是猪重要的病毒性传染病之一，20 世纪60 年代以前，PR 在中国已经流行［1］。中国为了控制猪PRV 感染，1979 年从匈牙利进口了Bartha-K61 疫苗株，自20 世纪80 年代末以来，Bartha-K61 疫苗在中国得到广泛应用，并取得了良好的效果，猪群新生仔猪的发病率和死亡率低于10%［2］。但在2011 年底，很多猪场PR 发生突然，进展迅速，感染率高；疫苗保护效果不佳，损失惨重［3］。这使得原本稳定的伪狂犬病又开始在中国肆虐。甚至接种了Bartha-K61 弱毒疫苗的规模化猪场也出现了猪伪狂犬的发病，流行趋势愈演愈烈［4］，给养殖户造成巨大的经济损失。为了预防、控制并最终根除该病，各国研究学者对该病进行了大量的研究，同时建立了许多针对该病的研究和诊断方法，现就PR 的研究进展综述如下。

1 病原学和流行病学

1.1 病毒结构和特性

伪狂犬病毒（PRV）属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，水痘-带状病毒属。成熟的PRV 病毒粒子为球形，直径为120～300 nm，其大小差异多由病毒体皮层的厚度变化及包膜的完整性所致，成熟完整的PRV 病毒颗粒与其他的疱疹病毒相似，有4 层结构，从内到外依次为核心、衣壳、被膜和囊膜。PRV是疱疹病毒中抵抗恶劣环境能力比较强的一种。PRV 在液体中或固体表面至少能存活7 d，在猪舍内干草上的病毒夏季可存活30 d，冬天可达46 d。55～60 ℃经过30～50 min 才能灭活，而80 ℃需要3 min 才能灭活。尽管PRV 比单纯疱疹病毒更耐热，但病毒不能保存于4～30 ℃条件下，否则病毒的感染力会在两周内降至原来的10%。最适保存温度为-70 ℃，真空干燥低温保存的病毒培养物能够保存多年［5］。

1.2 病毒感染动物机体过程

疱疹病毒为了保持其在宿主种群中始终存在，在宿主的神经系统中建立了潜伏感染。感染、潜伏感染和再激活是病毒存活关键的循环。通过研究，人们已知PRV 的DNA 既可以以附体的形式存在，也可以插入潜伏感染的神经细胞DNA。一方面，潜伏的基因一般为沉默基因，当受到外界的刺激后，潜伏感染可被再激活，病毒可通过轴突运输返回外周组织，通过口、鼻或生殖道分泌物排毒。另一方面，PRV 潜伏感染的细胞可能逃避了免疫系统的清除。在研究PRV 对细胞凋亡的作用时发现，PRV 可以诱导免疫细胞死亡，阻碍或延迟被病毒侵染的神经细胞的凋亡，并在被侵染细胞内最大限度地增值。因此，在免疫细胞遭到破坏时，机体免疫系统不一定能清除含有被PRV 侵染的细胞［5］。

1.3 血清学检测及流行分布

自2011 年10 月以来，中国大部分省份出现了PR 大范围暴发流行，其特点是：发病猪场PRV 野毒抗体（gE 抗体）阳性率显著上升，猪发病率达50%。2012 年中国首次颁布了《国家中长期动物疾病防治规划（2012—2020 年）》，将PR 列为重点优先防治动物疫病之一。通过加大疫病监测、流行病学调查等措施，计划在2020 年底前将PR 净化或根除［6］。为此，陆续有学者对PRV 野毒在不同年份、不同区域、不同季节和不同猪群的感染情况做了流行病学调查。

邹敏等［7］调查了2012—2013 年全国18 个省份393 个规模化猪场组织样品，采用PCR 和ELISA 方法对14 801 份血清样本和14 个省份的1 127 份组织样品进行了检测，结果显示2012—2013 年，PRV野毒感染总体阳性率为24.82%，猪场阳性率为66.51%。不同地区均存在不同程度的PRV 野毒感染，感染率呈逐年上升趋势。Liu 等［8］调查了2013—2016 年全国28 个省份的100 个规模化猪场伪狂犬病gB 抗体和gE 抗体阳性率，采用ELISA 方法对14 147 份样品进行检测，结果显示，PRV-gB 阳性率保持稳定（＞90%），PRV-gE 阳性率呈逐年下降趋势且不同地区流行程度不一，呈散发和地方性流行。

Sun 等［9］调查了2012—2017 年中国27 个省猪伪狂犬病在不同季节gE 抗体阳性率，采用PCR 方法对16 256 份样本进行检测。调查结果显示在不同月份和季节中，春季（3、4 月）和冬季（11、12 月）猪伪狂犬病野毒感染阳性率比其他季节和月份稍高。伪狂犬病的流行以寒冷的冬、春季节多发。寒冷季节低温有利于病毒在环境中存活，增加感染宿主的概率，冬、春季节早晚温差大，气温变化比较剧烈，且冬、春季猪舍封闭，通风不良，降低了猪的免疫力，有利于病毒感染和潜伏病毒的激活，导致伪狂犬病例增多。

党占国等［10］调查了2012—2015 年中国16 个省不同猪龄不同类型的猪群gE 抗体阳性率，采用ELISA 方法对3 549 份样品进行检测。结果显示，在不同阶段猪群中，后备母猪感染率最高，其次是育肥猪和哺乳仔猪。

血清流行病学调查显示，中国各省份都存在伪狂犬病毒流行，但流行程度不一，多为潜伏感染。不同猪场野毒感染程度差异大，不同生长阶段伪狂犬病毒感染率也不同，主要呈散发和地方性流行。

2 猪伪狂犬病毒变异株研究

2011 年10 月以后，中国多个省份使用Bartha-K61 弱毒株疫苗的规模化猪场发生猪伪狂犬病的流行，发病率和死亡率明显上升，且出现了新的发病特征。随后多名学者分离到新病毒，并且证实为PRV变异株。杨涛等［11］在分子水平上通过二代测序方法比较了Bartha-K61 疫苗株与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株之间的免疫原性差异。分析结果显示，Bartha-K61 疫苗株与变异株gB 蛋白优势抗原表位区59～126、214～289、507～734 位氨基酸处均存在差异，与gC 蛋白抗原指数之间发生了漂移，与gD蛋白共有10 处特征性差异，其中第277 位和第278位插入了RP。这些差异可能引起B 细胞线性表位和构象表位发生变化，引起免疫逃逸，导致不能提供完全的保护。

范克伟等［12］对2013—2014 年闽西地区分离到的15 株PRV 中gE 基因进行遗传变异分析，结果显示，gE 氨基酸序列在第48 位和第496 位各有1 个天冬氨酸（D）的插入，虽然部分经典毒株在第48 位也有天冬氨酸插入，但2012 年以来国内不同省份陆续分离的PRV 变异株在这2 个位点却高度一致。此外，赵鸿远等［13］发现吉林省、黑龙江省分离的PRV 在gE 蛋白这2 个位点也各存在1 个天冬氨酸的插入，与参考文献［12］结果一致，该插入特征为PRV 变异毒株的重要标志。此外，gE 蛋白N 端的第33～100 位氨基酸具有高度的抗原性和免疫原性。而变异株在该区段有4 个氨基酸位点发生改变，这些位点的氨基酸改变可能会对抗原性产生一定的影响，这也可能是导致现有疫苗对当前PRV 新流行毒株不足以提供完全保护的原因之一。

另外，国内学者也做了相应的动物试验。Luo等［14］从Bartha-K61 免疫猪群中分离到伪狂犬病变异毒株（TJ 株），免疫保护试验结果显示，Bartha-K61 的免疫保护力仅为33.3%。Gu 等［15］研究发现Bartha-K61 免疫猪群产生针对新分离毒株ZJ01 的中和抗体水平较低，经新分离毒株ZJ01 攻毒后，Batha-K61 免疫猪群均表现出抽搐、共济失调等神经症状。

综上研究结果表明，对于当前流行的PRV 变异株的致病力显著强于经典毒株，传统疫苗（Bartha-K61 株）已不能提供全面而有效的保护力。原因可能有两点：一是流行毒株发生变异，并存在免疫逃逸现象；二是狂犬病毒毒力基因发生了位点的缺失或突变，使伪狂犬流行毒株的毒力增强，疫苗产生的保护力不足以抵抗强病毒入侵，从而导致免疫失败［11］。

3 诊断方法

3.1 临床诊断

猪感染伪狂犬病毒后，临床症状和病程根据年龄不同有很大差异（表1）。

3.2 血清学诊断

在猪伪狂犬病的诊断方法中，利用血清学方法对猪血清展开抗体检测是常用的诊断手段，不同的血清学方法有着不同的特点（表2）。

3.3 鉴别诊断

在猪伪狂犬病诊断中，鉴别诊断ELISA 是一种新型诊断方法。目前基因缺失、疫苗缺失的非必需基因主要是gC、gE 和gG［16］（表3）。目前世界范围内，所有PRV 疫苗均缺失gE 基因，能够通过gE—ELISA 方法实现鉴别诊断。统一的标准为PRV 的防控和净化打下了坚实的基础。

表1 猪不同生长阶段感染PRV 的临床症状

表2 不同血清学检测方法的优缺点

表3 PRV 鉴别诊断优缺点

4 疫苗

4.1 猪伪狂犬病灭活疫苗

伪狂犬病灭活疫苗主要是以伪狂犬病毒野毒直接灭活或以基因缺失的病毒灭活以后加入适当佐剂制备的。伪狂犬灭活苗安全性高，不会向外界排毒，也不存在因疫苗毒在体内发生变异和重组而致毒力增强的风险［17］，因此，PRV 灭活疫苗可以用于所有猪群的免疫，包括仔猪和妊娠母猪。目前鉴于鉴别诊断的需要，使用特定基因缺失的PRV 灭活疫苗被广泛接受。母猪免疫后，能产生较高水平的母源抗体，给仔猪提供被动免疫。但与活疫苗相比，灭活疫苗缺点也很明显，灭活疫苗不能诱生可能在保护性免疫反应中起主导作用的细胞毒性T 细胞反应（CTL），肌内注射灭活疫苗能诱导产生IgM、IgG1 与IgG2，但没有黏膜IgA 产生，因此局部免疫效果不及活疫苗。另外，灭活疫苗抗原成分含量不高以及灭活过程中主要抗原决定簇丢失，因而常需要多次接种，而且应用佐剂可能对机体产生副作用，如食欲下降、高热等。因此，灭活疫苗在预防效果上还有待进一步提高。

4.2 猪伪狂犬病活疫苗

活疫苗与灭活疫苗相比，活疫苗能够激发机体的体液免疫和细胞免疫，整体保护力更强，免疫效果更佳。但活疫苗毒力不稳定，有潜在的返强危险。易在靶动物体内复制，形成潜伏感染的危害，应激条件下能够被激活，形成复发性感染并向外散毒的危险［18］。

4.3 变异株疫苗

过去的几十年，猪伪狂犬病疫苗Batha-K61 株在中国普遍使用，猪伪狂犬病的流行得到了有效的控制，但由于新型PRV 变异病毒的出现，中国猪群中PRV 感染情况日益恶化。众多机构开展了疫苗研制工作。田克恭团队研制了猪伪狂犬变异株灭活疫苗（HN1201-gE 缺失株）并在3 周龄的猪身上进行了攻毒试验。所有接种疫苗的猪均存活，未出现明显临床症状，且产生高水平的gB 和中和抗体，但未接种疫苗的猪均出现体温升高和神经系统症状，感染后6 d 内死亡率为100%［19］。

4.4 以伪狂犬株为载体的重组疫苗

由于PRV 基因组庞大，具有较多的增值非必需基因和非编码区，在这些区域缺失或插入外源基因不影响PRV 的复制，且以PRV 作为载体具有很多天然的优势，因此，开发PRV 为载体的重组二价或多价疫苗成为PRV 研究的一大热点。但由于PRV属于裂解感染型病毒，感染周期短导致重组病毒产生的蛋白量较少，所以，迄今为止还没有一种以PRV 为载体的重组疫苗上市。

5 根除计划

随着对伪狂犬病流行病学特征、病毒致病机理研究的深入，尤其是基因工程标记疫苗和配套鉴别诊断方法的推广使用，伪狂犬病得到了较好的控制。在国际上，多数欧美和亚洲发达国家均已经成功消灭了该病。中国在《国家中长期动物疾病防治规划》（2012—2020 年）中已将PR 列为重点优先防治动物疫病之一。为深入落实有关目标和要求，2014 年农业部开展了动物疫病净化示范场和动物疫病净化创建场评估认证。经过几年的努力，PRV 的控制和净化技术得到了验证，中国猪群PRV 野毒感染情况已经趋于稳定。

6 结语

猪伪狂犬血清流行病学研究结果显示，自2012年以来中国各省都存在伪狂犬病毒流行，流行程度不一，不同地域之间的PRV 野毒感染程度差异大，猪不同生长阶段，伪狂犬病毒野毒感染率也不相同，这可能与取样范围和调查的区域有关。但从总体来看PRV 野毒感染呈下降趋势。虽在2011 年以后中国出现了伪狂犬变异株流行，但国家很快便出台了猪伪狂犬病的根除计划，用gE 基因缺失疫苗与gE抗体检测试剂盒配套使用，剔除野毒感染猪，并加强猪场生物安全措施、引种监测、严防新毒株的传入。对感染猪场在做好疫苗免疫接种的基础上，加强后备种猪的监测，用阴性后备种猪逐步替换和淘汰阳性种猪，最终建立阴性种猪群，达到阴性种猪场的标准。目前，猪伪狂犬病得到了较好的控制，但是与发达国家相比依然有很大的差距。中国养猪业的养殖规模、模式和品种多种多样，再加上地域广阔，气候、猪群健康水平不同，因此，疾病的净化与根除需要各部门、各领域协同工作，将是一个系统而长期的过程。