不同贮藏温度下甲鱼肌肉品质和ATP 关联产物变化研究

孙钦军,包建强,2,3*,徐志善,王锡念,马翼飞

(1 上海海洋大学食品学院,上海201306;2 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306;3农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海201306)

甲鱼,学名鳖(Trionyx sinensis),俗称团鱼、脚鱼等,隶属于鳖科(Trionychidae)鳖属(Trionyx)[1],在中国大部分地区均有分布。 甲鱼具有较高的食药价值,蛋白质含量丰富、酶类生物活性较强,死后极易发生腐败变质。

目前,水产品常用保鲜方法有低温保鲜、真空保鲜、气调保鲜、化学与辐射保鲜等,其中低温保鲜以良好的保鲜效果受到众多学者的关注[2-3]。 李越华等[4]研究表明,在-3 ℃条件下,鲫鱼货架期较4 ℃延长16 d,微冻贮藏具有更好的保鲜效果,能明显延长鲫鱼货架期。 王立娜等[5]研究表明, -2 ℃贮藏的鲤鱼肉在感官品质、色泽与挥发性成分的变化上优于4 ℃冷藏。 Alasalvar 等[6]研究表明,第12 天时,4 ℃冷藏条件下与-3 ℃微冻条件下养殖鲷鱼和野生鲷鱼的肌苷酸(IMP)含量相比第0 天分别下降98.8%和81.3%,4 ℃冷藏条件下IMP 含量的下降速率显著大于-3 ℃微冻贮藏的速率。 目前,国内外主要对甲鱼的生活环境、营养价值、药用价值及基因等[7-9]方面进行研究,而对低温贮藏过程中甲鱼品质变化的研究未见相关报道。

本试验以甲鱼作为研究对象,依据家庭贮藏习惯,选取冷藏室温度(4 ℃、0 ℃)与微冻室温度( -3 ℃)为贮藏条件,测定甲鱼肌肉菌落总数、pH、硫代巴比妥酸值(TBARS)、挥发性盐基氮(TVB-N)、ATP 关联产物、K 值和感官品质等指标,研究不同贮藏温度下甲鱼肌肉品质的变化规律,以期为甲鱼低温保鲜与加工研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜甲鱼购于浙江省宁波市明凤渔业有限公司,甲鱼质量(750 ±50)g∕只,均为同龄甲鱼,活体运至实验室。

DSC-Q2000 型差示扫描量热仪(美国TA 仪器公司),LRH-100CA 型、DHP-9162 型恒温恒湿培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),H1850R 型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),YXQ-LS-30SH 型全自动压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司),Waters-e2695 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司),S2 型pH 计(梅特勒-托利多仪器有限公司),UV-757 型紫外分光光度计(杭州科晓仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

甲鱼宰杀后,无菌水洗净、沥干,将处理干净的甲鱼肌肉装入PE 保鲜袋中,排出空气,分装,置于4 ℃、0 ℃、-3 ℃的恒温恒湿箱内贮藏。 4 ℃、0 ℃处理每2 d 测定一次指标,-3 ℃处理每3 d 测定一次指标,各指标均重复测定3 次。

1.2.2 冰点测定

参考刘大松[10]测定冰点的方法,采用差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)测定甲鱼冰点。 准确称取甲鱼肌肉5—12 mg,加入已知质量的铝坩埚,选取相同质量的铝坩埚作为空白对照,铝坩埚压封,上机测定。 设置程序:初温为10 ℃,以50 ℃∕min 降温至-40 ℃,恒温5 min,以5 ℃∕min 升温至5 ℃。 降温曲线的峰起始温度为冻结温度,升温曲线的峰值相变温度为熔融点温度,即为甲鱼冰点温度[11]。

1.2.3 菌落总数测定

采用GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》的方法测定甲鱼肌肉的菌落数量。

1.2.4 pH 测定

用剪刀剪碎甲鱼肌肉并混合均匀,准确称取5.00 g 肉样,加入45 mL 去离子水(煮沸后冷却至室温),均质后静置30 min,测定pH 并记录。

1.2.5 硫代巴比妥酸值(TBARS)测定

参考Siu 等[12]方法测定。

1.2.6 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

测定方法参照GB∕T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》。

1.2.7 ATP 关联产物与K 值测定

参照Yokoyama 等[13]的方法测定ATP 关联产物。 精确称取甲鱼肌肉5.000 g,剪碎待用,加入10 mL预冷的10%高氯酸,均质机匀浆后,4 ℃下10 000 r∕min 离心10 min,取上清液,用10 mL 预冷的5%高氯酸洗涤沉淀,离心,合并上清液。 用氢氧化钠溶液调节pH 至6.5,转至50 mL 容量瓶定容,摇匀后0.45 μm膜过滤,上机HPLC 分析,外标法定量。

K值是ATP 的分解产物次黄嘌呤核苷(HxR)与次黄嘌呤(Hx)总量占ATP 关联物总量的百分比,通过ATP 关联物含量的变化可计算出K值[14]。K值低于20%被认为是一级鲜度,20%—60%为二级鲜度,60%—80%则处于初期腐败状态[15],K值超过60%就表示该样品无法食用。

式中:ATP(腺苷三磷酸)、ADP(腺苷二磷酸)、AMP(腺苷酸)、IMP(肌苷酸)、HxR、Hx 均为样品中的含量,单位为μmol∕g。

1.2.8 感官测定

参考GB∕T 29605—2013《感官分析 食品感官质量控制导则》并结合甲鱼实际特点制定感官评价表(表1)。 以表1 中指标为评分标准,由10 名感官评定人员对贮藏期内的甲鱼肌肉进行评分,感官评定结果取平均值,平均分16 分以上为一级鲜度,10—16 分为二级鲜度,低于10 分为不可接受。

表1 甲鱼肌肉感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of soft-shelled turtle muscle

1.3 数据处理

采用Excel 2016 和SPSS Statistics 22.0 软件进行数据分析与差异性显著分析,P＜0.05 表示具有显著性差异;利用Origin 9.1 软件制图,数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 冰点测定

图1 为甲鱼肌肉熔融DSC 曲线,热流为负值,表示处于吸热过程,温度在未进入冰温带之前,热流平稳,所需能量未出现显著变化;甲鱼肌肉进入冰温带,热流变化显著,所需能量增加,在-1.43 ℃达到最大值,因此判定甲鱼冰点温度为-1.43 ℃。 根据微冻定义,微冻贮藏温度一般低于冰点温度1—2 ℃,结合家庭冰箱微冻室温度,选取-3 ℃为甲鱼微冻贮藏温度。

2.2 不同贮藏温度下甲鱼肌肉菌落总数的变化

如图2 所示,不同贮藏温度下甲鱼肌肉菌落总数均不断增加,4 ℃贮藏甲鱼肌肉菌落总数增长速率显著高于0 ℃和-3 ℃贮藏,贮藏8 d 后菌落总数显著超出限量标准[6.0lg(CFU∕g)][16]。 0 ℃和-3 ℃条件下甲鱼肌肉菌落总数分别在贮藏前6 d、15 d 增长相对缓慢,随后菌落总数增长速度加快,并分别于15 d、27 d 超出限量标准。 如以菌落总数为参考依据,4 ℃、0 ℃和-3 ℃贮藏条件下甲鱼肌肉货架期分别为6 d、13 d 和26 d,-3 ℃贮藏时间较4 ℃和0 ℃贮藏分别延长了7 d、13 d,-3 ℃贮藏可以有效降低甲鱼肌肉微生物生长繁殖的速度,延缓甲鱼肌肉品质劣变。

2.3 不同贮藏温度下甲鱼肌肉pH 的变化

如图3 所示,贮藏期间甲鱼肌肉pH 呈先降后升的“V”型趋势,不同贮藏温度下甲鱼肌肉pH 变化均在6.79—7.00,4 ℃、0 ℃和-3 ℃条件下甲鱼肌肉分别在2 d、4 d、9 d 降至最小值,随后呈上升趋势。4 ℃、0 ℃和-3 ℃贮藏条件下甲鱼肌肉pH 分别于8 d、14 d 和27 d 升至7.01、6.97、6.98,-3 ℃贮藏条件下甲鱼肌肉pH 增加速度显著低于4 ℃和0 ℃贮藏。

2.4 不同贮藏温度下甲鱼肌肉TBARS 值的变化

如图4 所示,新鲜甲鱼TBARS 值为0.145 mg MDA∕kg,随着贮藏时间的延长,不同贮藏温度下甲鱼肌肉TBARS 值均呈上升趋势,4 ℃贮藏甲鱼肌肉脂肪氧化酸败变化速度显著高于0 ℃与-3 ℃贮藏。4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下TBARS 值在8 d、14 d、27 d 分别升至0.512 mg MDA∕kg、0.468 mg MDA∕kg、0.496 mg MDA∕kg,-3 ℃贮藏在延缓甲鱼肌肉脂肪氧化酸败方面具有明显的优势。

2.5 不同贮藏温度下甲鱼肌肉TVB-N 值的变化

依据国标GB 2733—2015《食品安全国家标 准鲜、冻动物性水产品》规定,淡水鱼虾类挥发性盐基氮含量不得超过国家二级鲜度标准[20 mg∕(100 g)]。 如图5 所示,不同贮藏温度下甲鱼肌肉挥发性盐基氮含量均呈不断上升的变化趋势,4 ℃、0 ℃条件下甲鱼肌肉TVB-N 值增加速度显著高于-3 ℃贮藏,4 ℃、0 ℃分别贮藏8 d、16 d 超出国家二级鲜度标准,-3 ℃贮藏27 d 才超出国家二级鲜度标准,-3 ℃贮藏减缓了低级胺类化合物生成速度,延长了甲鱼肌肉贮藏时间。 如以TVB-N 值为依据,4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下甲鱼肌肉的货架期分别为6 d、15 d、26 d。

2.6 不同贮藏温度下甲鱼肌肉ATP 关联产物与K 值的变化

由图6A 可知,不同贮藏温度下甲鱼肌肉ATP 值均呈下降趋势(P＜0.05),贮藏前期,4 ℃、0 ℃、-3 ℃处理甲鱼肌肉ATP 含量分别在2 d、4 d 、6 d 下降超过90%,之后各处理ATP 含量均处于较低水平且趋于稳定。

如图6B 所示,不同贮藏温度下甲鱼肌肉IMP 含量均呈现先上升后下降变化趋势,4 ℃和0 ℃在贮藏2 d 时达到峰值(1.18 μmol∕g 、1.88 μmol∕g),-3 ℃处理在第3 天达到峰值(2.09 μmol∕g),随后IMP 含量均呈下降趋势。 贮藏结束时,IMP 含量分别为0.018 μmol∕g(4 ℃,8 d)、0.027 μmol∕g(0 ℃,14 d)、0.013 μmol∕g( -3 ℃,27 d)。 与4 ℃和0 ℃贮藏相比, -3 ℃贮藏能有效降低甲鱼肌肉IMP 分解速率,延长肌肉鲜味保持时间。

甲鱼肌肉HxR 含量整体呈先上升后下降变化趋势(图6C),4 ℃、0 ℃和-3 ℃贮藏温度下分别于4 d、6 d 与12 d 升至最大值,之后HxR 含量分别于8 d、14 d、27 d 降至0.375 μmol∕g、0.243 μmol∕g 和0.225 μmol∕g。

如图6D 所示,4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下甲鱼肌肉Hx 含量均随时间延长不断增加,贮藏末期Hx 含量分别增至0.435 μmol∕g(8 d)、0.432 μmol∕g(14 d)、0.441 μmol∕g(27 d)。 随着Hx 含量不断增加,甲鱼肌肉也逐渐趋于腐败。

由图7 可以看出,不同贮藏条件下甲鱼肌肉K 值均呈上升趋势,0 ℃和-3 ℃贮藏条件下K 值变化速度显著低于4 ℃贮藏。 4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下甲鱼肌肉K 值分别于3 d、5 d、9 d 超过国家一级鲜度标准,于8 d、14 d和27 d 超过国家二级鲜度标准。 以K 值为依据,4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下甲鱼肌肉货架期分别为7 d、13 d、26 d。

2.7 不同贮藏温度下甲鱼肌肉感官品质的变化

如图8 所示,不同贮藏温度下甲鱼肌肉感官品质均随贮藏时间的延长而下降,温度越低,下降速度越慢。 贮藏过程中4 ℃、0 ℃、-3 ℃处理甲鱼肌肉分别在3 d、5 d、9 d 进入国家二级鲜度范围,此结果与K值测定结果一致,之后3 组分别于8 d、14 d、27 d 超出可接受范围,甲鱼肉色泽暗淡,原有气味消失,粘液较多。 通过感官品质评定发现,-3 ℃贮藏条件下甲鱼肌肉在感官品质方面具有明显的优势,甲鱼感官品质变化速度相对较慢。 以感官品质为依据,4 ℃、0 ℃、 -3 ℃贮藏条件下甲鱼肌肉货架期分别为7 d、13 d、25 d。

3 讨论与结论

甲鱼肌肉腐败变质原因主要有两个:一是外界微生物的污染,二是肌肉自身酶的活动[17]。 微生物生长繁殖与酶的活性均受温度的影响。 4 ℃不足以抑制微生物与酶的活性,甲鱼肌肉蛋白质在水解酶的作用下分解为氨基酸及挥发性氨、三甲胺和二甲胺等低级胺类化合物[18],促使TVB-N 含量显著上升,同时细菌利用氨基酸等大量繁殖并产生氨、吲哚、硫化氢、组胺等有腐臭味的物质[19],造成甲鱼肌肉鲜度下降。0 ℃和-3 ℃处于甲鱼肌肉冰温带,大部分微生物与酶的活性被抑制,同时细菌体液中水分部分冻结,体积增大产生挤压,使菌体破裂死亡[20],其菌落总数分别在6 d、15 d 前增长缓慢,随着贮藏时间的延长,肌肉体表与体内的微生物逐渐适应环境大量繁殖,TVB-N 含量增加,甲鱼肌肉鲜度下降,品质劣变速度增快。 对菌落总数与TVB-N 值、K 值进行相关性分析发现,4 ℃、0 ℃、 -3 ℃条件下甲鱼肌肉菌落总数与TVB-N 值相关系数为0.997、0.944、0.944,与K 值相关系数为0.989、0.959、0.891,表明TVB-N 值、K 值变化与菌落总数变化具有高度一致性,微生物是影响甲鱼肌肉品质劣变的重要因素。

贮藏过程中脂质氧化会导致风味劣变、营养损失,甚至会产生毒素,严重影响甲鱼肌肉品质[21]。 本试验发现,低温有效延缓了不饱和脂肪酸氧化酸败,-3 ℃贮藏TBARS 值增长速度显著低于4 ℃和0 ℃贮藏。 TBARS 值以丙二醛(MDA)含量反映脂肪氧化酸败程度,当TBARS 值超过1.0—2.0 mg MDA∕kg 时肌肉会产生不良气味[22],4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下贮藏8 d、14 d、27 d 甲鱼肌肉已无法食用,但其TBARS 值仍未超过阈值,其原因可能是MDA 与胺类、核酸、蛋白质、磷脂氨基酸以及脂肪氧化的终产物醛类物质发生反应[22],因此在判断甲鱼肌肉货架期时,TBARS 值不宜单独作为参考指标。

甲鱼宰杀后肌细胞中肌浆网的钙离子吸附能力下降,大量钙离子进入细胞液中,细胞液中钙离子浓度升高激活了肌原纤维ATP 酶的活性,ATP 被快速降解[23],同时肌肉也因ATP 分解产生的磷酸和无氧条件下糖原酵解产生的乳酸导致pH 下降,随着贮藏时间延长,甲鱼肌肉糖原酵解逐渐停止,ATP 降至较低水平,pH 出现最小值,随后微生物分解蛋白质产生的碱性物质逐渐增多,肌肉pH 逐渐升高。 4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下甲鱼肌肉IMP 含量贮藏期间均出现蓄积过程,之后在磷酸单酯酶和核苷水解酶作用下进一步分解产生HxR 和Hx[24],贮藏6 d, -3 ℃条件下IMP 含量为1.718 μmol∕g,4 ℃和0 ℃仅分别为0.762 μmol∕g 、0.257 μmol∕g,温度越低,IMP 分解速度越慢。 IMP 作为ATP 降解的中间产物,是鲜味的主要来源[25],降低温度有利于维持甲鱼肌肉鲜味,保持肌肉品质。 不同贮藏温度下甲鱼肌肉HxR 含量呈先升后降的变化趋势,贮藏前期HxR 生成速度显著大于降解速度,随着贮藏时间延长,核苷磷酸化酶降解HxR 速度逐渐增快,大量HxR 脱去1-磷酸核糖生成Hx[26],Hx 作为肉中苦味物质不断积累造成甲鱼肌肉新鲜度下降[27]。

水产品理化性质、微生物相关指标通常会与感官评价相结合[28]。 本试验中,4 ℃、0 ℃、-3 ℃条件下甲鱼肌肉感官评价分别于8 d、14 d、27 d 超出可接受范围,这与菌落总数、TVB-N 值和K 值所得结论相吻合。

本试验通过研究不同贮藏温度下甲鱼肌肉品质和ATP 关联产物变化发现,降低温度有助于延缓甲鱼肌肉品质劣变,延长甲鱼贮藏时间。 综合研究得知,家庭选取微冻贮藏(-3 ℃)更有利于维持甲鱼肌肉鲜度,保持甲鱼品质,4 ℃、0 ℃、-3 ℃贮藏货架期分别为6 d、13 d、25 d。