NS1 蛋白点突变对猪流感病毒感染细胞的影响

刘 雷,程靖华,石 迎,陶 洁,李本强,刘惠莉*

(1 上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106;2 上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;3上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)

猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)NS1 蛋白对病毒的毒力发挥具有重要作用[1-2]。 NS1 蛋白全长215—237 个氨基酸(Amino acid,aa),包括2 个功能区:一个是N 末端1—73aa 的RNA 结合区(RNAbinding domain,RBD),其中第19—38 位aa 为核心序列,是双链RNA(Double strand RNA,dsRNA)的识别序列,只有R38aa 是必需的,相邻aa 也发挥部分作用;另一个是C 末端效应结合区(Effector domain,ED),第134—161 位aa 是核心序列;N 末端和C 末端通过Loop 区连接[3]。 病毒在感染细胞期间,NS1 蛋白在细胞质中合成后被转移至细胞核中,在感染后期形成致密的晶体样包涵体积聚于核中[4]。 NS1 蛋白的主要作用是抑制宿主免疫应答,尤其是对I 型干扰素(IFN-α∕β)产生的抑制及对干扰素诱导产生的双链RNA 依赖性蛋白激酶R(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)和2’-5’A 合成酶(2’-5’oligoadenylate synthetase,OAS)抗病毒作用的抑制[5-6],以维持病毒感染力。

已有报道显示,NS1 蛋白能够通过序列中2 个核定位序列(NLS)和1 个核输出序列(NES)影响NS1蛋白的生物学功能。 经典的NLS1 位于保守的第34—41 位aa,NLS1 对NS1 蛋白结合RNA 活性以及蛋白质二聚化具有重要作用,根据Melen 等[7]的报道,在一株H1N1 人流感病毒中(A∕WSN∕33),NS1 蛋白第35、38、41 位的氨基酸通过与宿主蛋白中核输出蛋白α 的相互作用影响流感病毒的致病性。 Wang 等[8]也曾报道过在另一株H1N1 人流感病毒中(A∕Udorn∕72)中,NS1 蛋白的第38、41 位氨基酸对双链RNA(dsRNA)的结合活性具有重要作用。 NES 位于保守的第138—147 位aa,NES 具有阻断宿主mRNA 剪接、多聚腺苷酸化及核转运的功能,根据Tynell 等[9]的报道,在H1N1 人流感病毒(A∕Udorn∕72)突变NS1 蛋白NES 中的氨基酸后,NS1 蛋白的定位发生改变,病毒的复制能力和NS1 拮抗干扰素的能力也受到影响。已有大量的研究证实这2 个保守区域对病毒的致病性和蛋白的生物学功能具有重要作用,但关于猪流感病毒NS1 蛋白NLS1 和NES 的研究还未见报道。

本研究以A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)分离株为模板,利用定点突变技术对NLS1 和NES 氨基酸序列中保守氨基酸第36 位亮氨酸(Leucine,L)、第38 位精氨酸(Arginine,R)、第141 位亮氨酸、第144 位亮氨酸、第146 位亮氨酸用丙氨酸(Alanine,A)进行替换,构建5 个重组真核表达质粒,检测各突变蛋白在细胞中的分布及其对细胞因子水平的影响,以期深入了解NS1 的生物学功能及关键氨基酸位点的作用。

1 材料与方法

1.1 毒株、载体和细胞

SIV 分离株A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)由本实验室分离鉴定并保存,pCAGGS 载体、293T 和A549 细胞均由本实验室保存。

1.2 主要试剂和引物

质粒DNA 小提试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、预染蛋白质Marker(QIAGEN),T4 DNA 连接酶、限制性内切酶(NEB),Lipofectamine 2000、DAPI、DMEM 培养液、胎牛血清和Opti-MEM 低血清培养基(Invitrogen),Pyrobest DNA Polymeras、DL2000 DNA Marker(TaKaRa),FITC 标记山羊抗小鼠IgG(H +L)(上海碧云天生物技术有限公司)。 其他化学试剂均为分析纯。

根据A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)株NS1 序列,设计定点突变引物和特异性扩增引物,NS1 基因上下游引物分别添加EcoRⅠ和NheⅠ酶切位点。 根据GenBank 中的序列,设计IFN-β、OAS-1 和β-actin基因的扩增引物(表1),引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

1.3 NS1 及点突变基因的扩增与载体构建

以A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)毒株为模板,通过PCR 扩增NS1 基因并克隆至T 载体,筛选阳性质粒。 利用重叠延伸PCR 方法进一步扩增NS1 点突变基因,获得NS1 点突变基因片段。 PCR 反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,30 个循环;72 ℃延伸10 min。 通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物,并将目的DNA 片段切胶回收。 NS1 片段回收产物和pCAGGS 真核表达载体利用EcoRⅠ和NheⅠ限制性内切酶同时双酶切,经T4 连接酶连接,然后转化至DH5α 细胞。运用质粒PCR 和双酶切方法鉴定阳性重组真核表达质粒pCAGGS-NS1,并送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

按照上述方法构建点突变重组质粒pCAGGS-NS1L36A、pCAGGS-NS1R38A、pCAGGS-NS1L141A、pCAGGSNS1L144A、pCAGGS-NS1L146A。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.4 NS1 蛋白的表达

利用质粒DNA 小提试剂盒提取pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1L36A、pCAGGS-NS1R38A、pCAGGS-NS1L141A、pCAGGS-NS1L144A、pCAGGS-NS1L146A质粒,测定质粒浓度。 利用Lipofectamine 2000 将各重组质粒分别转染生长良好的HEK-293T 细胞,转染6 h 后移除原培养液,随后加入2 mL 无血清OPTI-MEM培养液继续培养。 转染48 h 后裂解细胞,提取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过半干法转印至NC 膜上进行Westernblot 检测。 一抗为NS1 多抗血清,孵育1 h,二抗为HRP 标记的羊抗鼠IgG,孵育1 h,显色液使用HRP-DAB。

1.5 NS1 蛋白的细胞定位

将各质粒转染细胞,分别在转染后12 h、24 h、36 h 弃去细胞上清;PBS 洗涤细胞,加入80%丙酮(预冷)固定细胞20 min;PBS 洗涤3 次,3 min∕次,自然干燥;加入1%Triton 细胞通透液,作用25—30 min;PBS 洗涤3 次,5 min∕次;加入5%脱脂牛奶,37 ℃封闭45 min;PBS 洗涤3 次,5 min∕次;加入NS1 多抗,37 ℃孵育1 h;PBS 洗涤后,二抗加入FITC 标记的羊抗鼠IgG(H+L),37 ℃孵育45 min;PBS 洗涤后加入1 μg∕mL DAPI 覆盖细胞,室温避光10 min;终止反应,在倒置荧光显微镜下观察重组蛋白表达及分布。

1.6 细胞因子的检测

将重组质粒分别转染A549 细胞,转染后12 h、24 h、36 h 提取细胞总RNA,反转录。 荧光定量PCR扩增IFN-β、OAS-1。

荧光定量PCR 数据采用2-ΔΔct方法计算,利用SPSS 21.0 软件分析各组间细胞因子水平的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 NS1 点突变真核表达质粒的构建与鉴定

利用重叠延伸PCR 方法,成功扩增NS1 及NS1L36A、NS1R38A、NS1L141A、NS1L144A、NS1L146A点突变基因片段,大小均为693 bp 左右,与预期相符(图1A)。 各片段运用T4 连接酶连接到pCAGGS 载体,经质粒PCR和EcoRⅠ、NheⅠ双酶切鉴定,获得阳性重组真核表达质粒pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1L36A、pCAGGSNS1R38A、pCAGGS-NS1L141A、pCAGGS-NS1L144A、pCAGGS-NS1L146A,其酶切结果见图1B。 测序验证表明,NS1蛋白序列中第36 位亮氨酸(L)、第38 位精氨酸(R)、第141 位亮氨酸(L)、第144 位亮氨酸(L)、第146 位亮氨酸(L)正确突变为丙氨酸(A)。

2.2 Western-blot 鉴定NS1 点突变蛋白的表达

将各质粒转染A549 细胞24 h,利用蛋白印迹检测法检测NS1 蛋白在A549 细胞中的表达情况(图2)。 结果显示:转染NS1 及其点突变质粒的细胞中能检测到约26 ku 的目的条带,与预期大小一致;空白细胞中和转染pCAGGS 空质粒的细胞中均未检测到NS1蛋白的条带,表明NS1 蛋白及其各突变体在A549 细胞中可以表达。

2.3 NS1 及其点突变蛋白在A549 细胞中的定位分析

将各质粒分别转染A549 细胞,利用间接免疫荧光分析NS1 及其点突变蛋白在细胞中的定位情况。结果表明:在转染12 h、24 h、36 h 后,NS1、NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A均匀分布在A549 的细胞核和细胞质中,NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A突变体蛋白与野生型NS1 蛋白在细胞中的分布没有差异;在转染24 h 时,NS1R38A在细胞核和细胞质中均有分布,在转染36 h 时,NS1R38A蛋白主要在细胞质中,细胞核中很少。 而NS1L144A主要分布在细胞质中,基本不分布于细胞核,说明NS1 蛋白中第144 位氨基酸与蛋白定位密切相关(图3)。

2.4 荧光定量PCR 检测免疫细胞因子的mRNA 转录水平

将NS1 及其各突变质粒转染A549 细胞,然后利用Real-time PCR 检测不同时间点免疫细胞因子的转录水平,以了解NS1 蛋白中关键氨基酸位点对细胞抗病毒反应的影响。 结果显示:各NS1 突变体蛋白在A549 细胞中INF-β 和OAS-1 的转录水平相比于没有突变的NS1 蛋白明显上升,且在36 h 时IFN-β 和OAS-1 转录水平达到最高,在24 h 时细胞转录IFN-β 水平比12 h 时增加近3 倍,24 h 时细胞OAS-1 转录水平比12 h 时增加近100 倍,说明细胞可以在短时间内激活细胞抗病毒反应。 值得注意的是,NS1R38A突变体蛋白诱导IFN-β 和OAS-1 的转录水平最高,NS1L144A突变体蛋白也可以诱导IFN-β 和OAS-1 处于较高的转录水平,提示它们对宿主细胞的抗病毒反应抑制能力最弱(图4—5)。

3 结论与讨论

在病毒感染周期中,宿主细胞中的免疫细胞因子通过激活多条途径抑制病毒复制和调控细胞凋亡,以减少病毒对宿主的损伤。 而流感病毒NS1 蛋白可以通过多种途径来应对这种抗病毒反应,包括抑制宿主干扰素产生、调节细胞凋亡、与宿主蛋白相互作用等方式,以抵抗宿主细胞产生的免疫反应[10]。

据报道,在病毒感染的细胞中,NS1 蛋白主要定位于细胞核,但在感染后的晚期细胞质中会发现很大比例的NS1 蛋白[11-14]。 病毒感染的细胞中NS1 蛋白的不同定位情况会影响宿主细胞的抗病毒反应机制。研究发现,NS1 蛋白在病毒感染细胞的细胞核中主要与CPSF30、PAPBII 相互作用,抑制宿主细胞mRNA加工修饰;而在病毒感染细胞的细胞质中主要与RIG-1、TRIM25 结合,抑制干扰素的产生[15]。 本研究以H1N1 亚型猪流感病毒A∕swine∕Shanghai∕3∕2014 为对象,在线预测了NS1 蛋白NLS 和NES 区域中影响先天免疫的关键氨基酸位点。 通过点突变构建NS1 突变体真核表达质粒,发现它们转染细胞后,出现了不同的定位情况。 NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A突变体蛋白和野生NS1 蛋白一样,均同时定位于细胞核和细胞质中;而在转染36 h 后,NS1R38A主要分布于细胞质中,细胞核中很少;在转染12 h、24 h、36 h 后,NS1L144A蛋白主要定位于细胞质中,仅有少量表达于细胞核中。 随着时间变化,各蛋白的定位情况没有发生变化,提示H1N1 亚型猪流感病毒NS1 蛋白中第38 位氨基酸可能有助于蛋白由细胞核向细胞质运输,第144 位氨基酸与细胞定位有着密切关系,可能影响宿主细胞的抗病毒反应机制。

最初研究表明,NS1 的特征在于通过阻止病毒RNA 和模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)的结合来拮抗Ⅰ型干扰素的应答。 随后证实,一方面,NS1 蛋白可以抑制蛋白激酶R(Protein kinase RNA,PKR)和OAS 活化,以及IFN 转录和IFN 前mRNA 的加工,通过调控机体抗病毒应答,从而间接增强病毒的致病力;另一方面,NS1 蛋白可提高病毒复制水平,增强病毒mRNA 的翻译,以此直接增强流感病毒对抗宿主的抗病毒应答能力。 本研究进一步检测了NS1 点突变对A549 细胞中INF-β 和OAS-1 转录水平的影响,结果显示:在转染后,细胞上调IFN-β 和OAS-1 的转录水平,且NS1 突变体蛋白比野生型NS1蛋白引起更高的INF-β 和OAS-1 转录,在转染36 h,IFN-β 和OAS-1 转录水平达到最高。 其中A549 细胞针对NS1R38A突变体蛋白诱导IFN-β 和OAS-1 的转录水平最高,A549 细胞针对NS1L144A突变体蛋白也可以诱导IFN-β 和OAS-1 处于较高的转录水平,揭示NS1R38A和NS1L144A突变体蛋白对宿主细胞的抗病毒反应抑制能力较弱。 值得注意的是,第38 位和第144 位氨基酸位点突变,引起NS1 细胞定位不同,但对IFN-β和OAS-1 转录的促进作用相似。

综上所述,H1N1 亚型SIV NS1 蛋白中第38 位和第144 位氨基酸与蛋白在细胞中的定位有关,可能影响宿主细胞的抗病毒反应。 NS1R38A和NS1L144A两个突变体蛋白能降低NS1 蛋白抑制IFN-β 和OAS-1 的作用,表明这两个位点是NS1 蛋白作用的关键氨基酸位点。