纳米银刻蚀比色法检测褪黑激素

肖传豪

(1.濮阳职业技术学院，河南 濮阳 457000;2.河南大学 濮阳工学院，河南 濮阳 457000)

褪黑激素是一种重要的激素，被证明可调节大脑的昼夜节[1]、线粒体内稳态[2]、氧化应激[3]和免疫[4]，因此实时监测褪黑激素的浓度水平可为炎症过程中的免疫调节机制提供有用信息。目前，褪黑激素的检测方法主要有高效液相色谱法[5-6]、微透析与高效液相色谱联用[7]法、电化学法[8-9]等，但这些方法检测速度慢，且灵敏度不高。比色法具有简单、可视化、无需复杂设备且检测速度快的特点，深受科研工作者的青睐。

与纯元素纳米粒子相比，双金属纳米粒子具有不同的组成和结构，以及明显的光学和催化性能，近年来受到广泛关注[10-12]。由于氯金酸和纳米银之间可发生氧化还原发应，使纳米银被氧化刻蚀成Ag+，同时Au3+被还原成Au沉积在刻蚀的纳米银表面形成双金属Ag-Au纳米粒子，导致溶液吸光度减小，同时溶液颜色由黄色变成橘黄色;而当不同浓度的褪黑激素存在时，褪黑激素会作为抗氧化剂抑制氯金酸对纳米银的刻蚀，导致溶液吸光度增大，颜色由橘黄色变为黄色。本文基于上述原理，以球形纳米银为比色探针，建立了一种简单、高专一性和高灵敏度的检测褪黑激素的比色分析方法，并将其用于人体尿液样品的测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UV-2550型紫外可见(UV-Vis)吸收光谱仪(日本岛津公司)；H-7560型透射电子显微镜(日本日立公司)；扫描透射电子显微镜(STEM)(单元具有高角度环形暗场)(HAADF)探测器(美国FEI公司)。

硝酸银、氯金酸(美国Sigma公司)；柠檬酸钠、褪黑激素(阿拉丁试剂(上海)有限公司)；所有试剂均为分析纯，无任何纯化步骤；实验用水为美国艾科浦公司生产的实验室级超纯水。

1.2 球形纳米Ag的制备[13]

将10 mL甘油和40 mL水在100 mL烧瓶中混匀，置于95 ℃油浴中，以1 200 r/min的速度剧烈搅拌；然后向溶液中添加9 mg AgNO3，反应1 min后，向混合物中注入1 mL 3%柠檬酸钠；再将溶液置于95 ℃下搅拌1 h并冷却至室温，于4 ℃冰箱冷藏，备用。在475 nm处测定溶液吸光度值，根据朗伯-比尔定律确定纳米银溶液的浓度，其消光系数为2.7×108L/mol·cm。

1.3 实验方法

将100 μL不同浓度的褪黑激素溶液、HAuCl4(50 μL，5 μmol/L)和50 μL B-R缓冲液(含0.04 mol/L磷酸、硼酸、乙酸和0.2 mol/L NaOH，pH 7.0)混合反应60 min。然后加入800 μL纳米银溶液孵化15 min。以水为参比溶液，在室温下记录400～800 nm处的纳米银紫外吸收光谱，于475 nm处测定褪黑激素溶液吸光度(A)和不含褪黑激素溶液的吸光度(A0)，计算ΔA=A-A0。以ΔA为纵坐标，褪黑激素浓度的对数(lgC)为横坐标绘制标准曲线，计算褪黑激素含量。

图1 基于褪黑激素抑制纳米银刻蚀比色法检测褪 黑激素原理示意图Fig.1 Schematic of colorimetric detection of melatonin based on inhibition of Ag nanoparticles etching induced by melatonin

图2 球形纳米Ag(a)、纳米银-氯金酸(b)以及纳米银- 氯金酸-褪黑激素(c)的紫外吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of spherical Ag nanoparticles(a),Ag nanoparticles-HAuCl4(b) and Ag nanoparticles-HAuCl4-melatonin(c)

图3 氯金酸氧化刻蚀前(A)后(B)的纳米银透射电镜图 及纳米Ag加入氯金酸前(C)后(D)的元素映像图Fig.3 TEM images of Ag nanoparticles before(A) and after(B) being etched by HAuCl4,and elemental mapping of Ag nanoparticles before(C) and after(D) addition

2 结果与讨论

2.1 实验原理

氯金酸和纳米银的氧化还原反应见图1，纳米Ag表面被HAuCl4氧化刻蚀成Ag+，Au3+被还原为Au沉积在刻蚀的纳米Ag表面，形成Ag-Au纳米粒子，导致溶液吸光度降低，同时溶液颜色由黄色变为橘黄色。当向体系中加入褪黑激素后，褪黑激素与氯金酸发生反应，纳米银的氧化刻蚀被抑制[14-15]，使得溶液的吸光度增加，溶液颜色由橘黄色变为黄色。因此可通过纳米银的刻蚀引起吸光度和颜色的变化来测定褪黑激素含量。

2.2 纳米银表征

相比于加入前(图2曲线a)，将纳米银颗粒加入氯金酸中后，纳米银在475 nm处的溶液吸收峰显著降低，并伴随着红移(图2曲线b)，溶液颜色由黄色变为橘黄色；继续加入氯金酸和褪黑激素，相对于氯金酸-纳米银溶液的吸收峰，吸光度明显增加，溶液颜色由橘黄色变为浅黄色(图2曲线c)，表明褪黑激素能有效抑制纳米银被氯金酸氧化刻蚀。从球形纳米银和氯金酸反应前后的透射电镜照片(图3A、B)可见，反应后的纳米银表面出现介孔，表明氯金酸能很好地刻蚀纳米银。另外，纳米银和氯金酸反应前后的元素映像也证明纳米银被氯金酸刻蚀，同时生成的纳米金沉积在纳米银表面形成了Ag-Au纳米粒子(图3C、D)。

2.3 反应条件的优化

褪黑激素的孵化时间和缓冲溶液pH值对方法灵敏度影响显著，因此实验考察了不同反应时间(5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min)和不同pH值(2.90、3.05、3.43、4.47、5.27、6.34、7.00、7.50、8.04)的影响。结果显示，475 nm处的吸光度值随着反应时间的延长呈先增加后降低的趋势，在35 min时达最大值，表明此时褪黑激素和氯金酸反应完全，因此，选择褪黑激素的最佳反应时间为35 min；另外,H3PO4-HAc-H3BO3缓冲溶液的pH值在2.90～8.04范围内变化时，475 nm处的吸光度随着pH值增加逐渐增大，pH 7.00时接近最大值并趋于稳定，表明纳米银被刻蚀的程度逐渐减小，抗氧化剂的作用逐渐增大。通过颜色变化也可证明此结果，所以选择缓冲溶液的pH值为7.00。

图4 褪黑激素溶液的紫外吸收光谱曲线Fig.4 UV-Vis absorption spectra of the solution containing different concentrations of melatonin

图5 该比色传感器对褪黑激素的选择性Fig.5 Selectivity of the colorimetric sensor toward melatonin

2.4 灵敏度与线性范围研究

在最优条件下检测不同浓度(0～1 mmol/L)的褪黑激素，其UV-Vis光谱见图4。由图可见，Ag-Au溶液在475 nm处的吸收峰随着褪黑激素浓度的增加发生蓝移且吸收峰值增加，同时溶液的颜色也从橘黄色变为黄色，表明褪黑激素对氯金酸和纳米银之间的氧化刻蚀反应有明显的抑制作用。褪黑激素浓度(0.1 nmol/L～1 mmol/L)的对数值(lgC)与对应吸光度变化值(ΔA)呈良好的线性关系，线性方程为ΔA=0.049 8+0.516lgC，相关系数(R2)为0.996 4。以3σ(σ为标准偏差)计算得检出限为0.09 nmol/L。相比于其它褪黑激素的检测方法(如比色[16-18]、荧光[19]、表面增强拉曼[20]、电化学[21]和高效液相色谱法[5]),本法显示出更宽的线性范围和更低的检出限。

2.5 选择性实验

实验选择尿液中常见物质(如葡萄糖、抗坏血酸、尿素、多巴胺)为干扰物，验证方法对褪黑激素检测的选择性。结果显示，球形纳米银比色探针对1 μmol/L褪黑激素显示出强烈的响应，而对100倍浓度的葡萄糖、抗坏血酸、尿素、多巴胺的响应很低，可以忽略(图5)，表明该比色方法对褪黑激素具有很好的专一性。

图6 尿液中含不同浓度褪黑激素的紫外吸收光谱曲线Fig.6 UV-Vis absorption spectra of the solution containing different concentrations of melatonin in urine

2.6 尿液中褪黑激素的测定

向空白人尿中添加一定量褪黑激素，在优化条件下测定，考察该方法的实际应用能力，结果见图6。由图可见，纳米Ag-Au溶液的吸光度变化值(ΔA)与褪黑激素浓度的对数(lgC)在1～100 nmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为ΔA=0.219+0.021 7lgC，相关系数(R2)为0.975 3。另外，取葡萄样品，过滤后稀释，并分别添加不同浓度(0、1.0、10、100、1 000、10 000、100 000 μmol/L)的褪黑激素进行加标回收实验，计算得样品的平均回收率为97.0%～99.3%，相对标准偏差(RSD)不大于5.6%，表明本方法可用于实际样品中褪黑激素的检测。

3 结 论

本研究基于氯金酸和纳米银之间发生氧化反应使溶液颜色发生变化，而褪黑激素可抑制上述氧化的原理，建立了一种检测褪黑激素的简单、高度灵敏和选择性的比色法，并优化了褪黑激素的反应时间和缓冲溶液的pH值。在最优条件下，褪黑激素的线性范围为0.1 nmol/L～1 mmol/L，检出限为0.09 nmol/L，可用于人尿液和葡萄中褪黑激素的测定。