吴茱萸碱脂质纳米粒的药代动力学和在体肠吸收特性研究

杨 婕，刘宏明，陈 云，陈 冉，张景勍*

（1重庆医科大学药学院重庆高校药物工程研究中心，重庆400016；2重庆市南川区人民医院药剂科，重庆408400）

吴茱萸［Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.］，是芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，首载于《神农本草经》［1］。吴茱萸碱（evodiamine，EV）是中药吴茱萸的活性成分，可与多种蛋白质结合，作为多靶点药物用于治疗肿瘤、肥胖、疼痛、炎症、心血管疾病和阿尔茨海默病等疾病［2-4］。但由于EV 水溶性低，生物利用度低，限制了临床应用［5］。磷脂被广泛用于改善中药活性成分的水溶性和渗透性，能提高药物的吸收和生物利用度，并且由于本身是细胞膜成分，携带药物进入组织细胞时对细胞无毒性［6］。羟丙基-β-环糊精可以增加难溶性药物的溶解度和稳定性，并且具有抑制P 糖蛋白的作用［7］。本研究结合磷脂和羟丙基-β-环糊精作为药物递送载体的优势，首次制备负载EV 的脂质纳米粒（evodiamine lipidic nanoparticle，ELN），用于提高EV 在大鼠体内的药代动力学和在体肠吸收特性，旨在为EV 的临床研究提供理论基础。

1 材 料

1.1 药品与试剂

吴茱萸碱（纯度大于99%，武汉远城科技发展有限公司）；卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司）；羟丙基-β-环糊精（江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司）；和厚朴酚（内标，纯度大于99%，西安小草植物科技有限公司）；甲醇（色谱级，美国新天地科技有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

LC-2010AHT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB204-S电子天平（瑞士Mettler-Toledo仪器公司）；XSP-36-1600X 型生物显微镜（凤凰光学股份有限公司）；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Nano-ZS90 型马尔文粒径测定仪（英国马尔文公司）；3000N型扫描电子显微镜（日本日立公司）。

1.3 动 物

清洁级SD 大鼠，雄性，体重（250±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK-（渝）2018-0003。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 ELN的制备与表征

2.1.1 ELN 的制备 称取EV、卵磷脂和羟丙基-β-环糊精（物质的量比，1∶2.47∶5.11）置于50 mL的磨口圆底烧瓶中，加入无水乙醇20 mL，60 ℃水浴搅拌5 h（1 200 r/min）后旋转蒸发除去有机溶剂，残余物真空干燥后用氯仿溶解并过滤，沉淀用少量氯仿洗涤，合并滤液，减压回收有机溶剂，所得固体真空干燥后即为ELN。

2.1.2 光学显微镜观察ELN 的形态 分别取少量包含EV、卵磷脂和羟丙基-β-环糊精的物理混合物，ELN 固体置于载玻片上，将载玻片置于显微镜下，先于10 倍镜下观察，然后在40 倍镜下观察并照相。

2.1.3 扫描电子显微镜观察ELN 的形态 将ELN 粉末分散于pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，并将悬浮液1滴置于载玻片上。经固定、脱水和冻干后，涂覆金，并用扫描电子显微镜观察和拍摄其表面形态。

2.1.4 ELN 的粒径和电位 称取ELN 20 mg 混悬于超纯水3 mL 中，用超纯水稀释到原浓度的1/2，采用马尔文粒径测定仪测定ELN的粒径和电位。

2.2 药代动力学实验

2.2.1 给药方案和取血点 选用成年健康SD 大鼠6 只，随机分为2 组，每组3 只。两组SD 大鼠在给药前12 h 禁食不禁水。两组SD 大鼠分别单剂量灌胃给药EV 和ELN（按EV 计，给药剂量为250 mg/kg）。 给药后在预先设置的时间点（0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h）进行眼底取血，将血样置于含肝素的EP 管中，离心10 min 后分离血浆，置于-80 ℃冰箱保存［8-9］。

2.2.2 血浆样品处理 取血浆样品150 μL，加入内标工作液（20 μg/mL）10 μL，涡旋30 s，加入氨水75 μL，涡旋30 s，加入乙醚750 μL，涡旋3 min，取上清液600 μL至离心管中，40 ℃水浴挥干乙醚后，加入甲醇100 μL 涡旋1 min，离心半径10 cm，12 000 r/min，离心10 min，取上清液40 μL 进样检测［9］。

2.2.3 色谱条件 色谱柱Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 动 相 为 甲 醇- 水（75∶25）；检测波长为225 nm；流速为1 mL/min；柱温为35 ℃。内标（IS）为和厚朴酚，进样量为40 μL［10］。

2.2.4 样品中药物含量的测定 精密称取EV 20.00 mg，IS 10.00 mg，用甲醇溶解并用100 mL 棕色量瓶定容，得EV工作液和IS工作液。

标准曲线的建立：取空白血浆150 μL，精密加入IS工作液（20 μg/mL）10 μL，涡旋30 s，再分别加入不同质量浓度的EV 工作液稀释液40 μL，得EV梯度浓度范围为10～2 000 ng/mL 的系列含药血浆溶液（各样品中IS 的质量浓度为0.1 μg/mL），依照“2.2.2”项下方法进行血浆样品处理后，在“2.2.3”项条件下进样，测定各样品中EV 和IS 的峰面积，以EV 和IS的峰面积比（A）对EV 的质量浓度（c）进行线性回归，建立回归方程。

精密度：制备EV 质量浓度分别为100、500、1500 ng/mL 的血浆溶液，平行配制3 份，按照“2.2.2”项下方法进行血浆样品处理后，同1 d 内连续进样5 次检测，考察其日内精密度；持续进样5 d检测，考察其日间精密度。

回收率：制备低、中、高浓度的EV 血浆溶液，平行配制3 份，按照“2.2.2”项下方法进行血浆样品处理后，进样检测EV 的峰面积（Ar）。另外配制低，中，高浓度的EV 溶液各3份，加入IS（IS浓度均为0.1 μg/mL），并均用流动相进行稀释，使其与含EV 的血浆样品处理后的浓度相同，进样测定EV的峰面积（As）。Ar/As即为EV的回收率。

2.2.5 数据处理 根据测得数据，绘制血药浓度-时间曲线。用DAS 2.1.1 软件计算药代动力学参数。

2.3 在体肠吸收实验

2.3.1 色谱条件 色谱柱Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 动 相 为 甲 醇- 水（75∶25）；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长为225 nm。进样量为20 μL。

2.3.2 单向肠灌流模型考察在体肠吸收情况SD大鼠给药前18 h禁食不禁水。将大鼠麻醉后固定，沿腹中线打开，暴露腹腔。在胃幽门、贲门两侧各剪开一个小口，插管，将两端用线绳结扎。人工胃液排除胃内容物（重复3 次），分别灌入EV 和ELN 混悬液（按EV 计，给药剂量为90 μg/mL）4 mL，2 h 后取出药液，冲洗胃内的剩余药液，用10 mL 量瓶定容。依次找到以下肠段：幽门以下1 cm 处为十二指肠段，幽门向下15 cm 处为空肠段，至盲肠上段20 cm 处为回肠段，盲肠后段为结肠段。分别取各肠段10 cm，在上端和下端分别插管结扎，用37 ℃生理盐水将肠内容物冲洗干净。空白Krebs-Ringer 循环液以0.4 mL/min 流速平衡10 min后，更换为含药循环液，流速降低为0.2 mL/min，计时1 h 收集灌流液。冲洗胃肠道内的剩余药液，用25 mL 量瓶定容，并在-20 ℃条件保存，在“2.3.1”项下条件检测EV 含量。试验结束后测量各肠断长度和内径，计算药物吸收速率常数（Ka）和有效渗透率（Peff）［9］。

3 结 果

3.1 ELN的制备与表征

如图1-A 和1-B 所示，在光学显微镜下，包含EV、卵磷脂和羟丙基-β-环糊精的物理混合物呈大小不一的结晶状，而ELN 粉末呈不规则、非晶型，分布较物理混合物更加均一。如图1-C 所示，在扫描电子显微镜下，ELN 呈球形或类球形。粒径电位结果显示，ELN 的平均粒径为180.10 nm，平均Zeta电位为-17.90 mV。

Figure 1 Morphology of evodiamine lipidic nanoparticle(ELN)A: Optical photomicrographs of physical mixture;B: Optical photomicrographs of ELN;C: Scanning electron micrograph of ELN

3.2 ELN在大鼠体内的药代动力学

在该色谱条件下，EV 与IS 的保留时间分别为5.6 和8.1 min，峰形良好且血浆内源性物质不干扰测定。以EV 与IS 的峰面积比（A）对EV 的质量浓度（c）进行线性回归，得到回归方程为：A=1.128 9c + 0.070 9，r =0.999 8，EV 在10～2 000 ng/mL 质量浓度范围内线性良好。血浆样品溶液的日内精密度RSD 为1.40% ～4.10%，日间精密度RSD 为1.65% ～3.50%。回收率为102.70% ～108.55%。专属性、线性、精密度、回收率等实验结果均符合方法学要求，表明处理血浆的方法合理，符合测定要求，该法可行。

SD大鼠单剂量灌胃给药EV和ELN混悬液（按EV 计，给药剂量为250 mg/kg）后，按照“2.2.1”项下采集各时间点的血浆样品，并按“2.2.2”项下血浆处理办法，进行HPLC 分析，测定EV 的大鼠血浆浓度。灌胃给药EV 和ELN（按EV 计，给药剂量为250 mg/kg）的血药浓度-时间曲线如图2。实验结果表明，ELN 能显著增加大鼠体内EV 的浓度，提高EV的口服生物利用度。采用DAS 2.1.1软件分析药代动力学参数，非房室模型和房室药代模型参数见表1和表2，EV和ELN的药物代谢动力学行为均符合二室模型。ELN 将EV 的平均生物利用度提高4.73 倍，平均峰浓度提高了3.79 倍，平均滞留时间延长了1.60倍。

Figure 2 Plasm concentration-time profiles of evodiamine (EV) in rats after oral administration of ELN and EV at EV dose of 250 mg/kg(xˉ± s, n = 3)

Table 2 Main pharmacokinetic parameters calculated with compartment model after oral administration of ELN and EV at EV dose of 250 mg/kg (xˉ± s, n = 3)

Table 1 Main pharmacokinetic parameters calculated with non-compartment model after oral administration of ELN and EV at EV dose of 250 mg/kg (xˉ± s, n = 3)

3.3 在体肠吸收实验

大鼠胃部单向灌流2 h，肠段单向灌流1 h 后，收集剩余ELN 和EV 并测定其含量，计算Ka和Peff。ELN 和EV 在胃中的Ka以及在十二指肠、空肠、回肠和结肠的Ka和Peff见表3。结果表明，ELN 在胃肠段的Ka和Peff均大于原料药EV。对不同胃肠段的Ka和Peff进行单因素方差分析，结果表明ELN 在胃部和4 个肠段的Ka和Peff与原料药EV 混悬液相比均存在显著性差异（P ＜0.05）。其中，相比EV，ELN 的平均Ka在结肠增长倍数最高（比EV 高31倍），ELN 的平均Peff在十二指肠增长倍数最高（比EV 高11 倍）。EV 在胃部具有最高Ka，ELN 在结肠具有最高的Ka，提示ELN 在结肠吸收最快。EV 在结肠具有最高Peff，ELN 在十二指肠具有最高Peff。以上结果提示ELN 增强了胃肠道对EV 的吸收，而且可能具有结肠靶向作用。

Table 3 Absorption rate constant and effective permeability coefficient of ELN and EV (xˉ± s, n = 3)

4 讨 论

EV 具有低溶解性的特点，按照生物药剂学分类 系 统（biopharmaceutics classification system，BCS）的标准可将其归为BCS二类药物［11］。水溶性差的特点使其难以被吸收，生物利用度低，药理活性难以发挥。

磷脂是人体细胞膜成分，具有良好的生物相容性，可显著增强难溶性药物EV 的水溶性，使其更易从亲水环境转移到亲脂环境的肠上皮细胞膜［12-13］。羟丙基-β-环糊精可增加难溶性药物的溶解度（前期实验表明：EV 在水中的溶解度小于0.03 μg/mL，而羟丙基-β-环糊精和EV 形成的环糊精包合物在水中的平均溶解度为18.46 μg/mL，表明羟丙基-β-环糊显著提高了EV 的水溶性），是美国食品药品管理局批准的可用于注射的安全的药用辅料，其疏水的内腔和亲水的表面可包裹磷脂分子的脂肪酰基碳氢链，通过范德华力或静电作用力等发生包结作用，形成稳定的脂质纳米粒［14］。

为更好地提高EV 的水溶性，以促进其吸收，本研究采用羟丙基-β-环糊精结合卵磷脂来递送EV，成功构建脂质纳米粒ELN（前期实验表明：在热分析实验中，ELN 的特征吸热峰相比EV 和辅料有显著差异，表明ELN 成功合成），以期改善EV 的水溶性，提高EV 的生物利用度。在体肠吸收特性表明ELN 能够使EV 更好地被胃肠道吸收，且ELN在结肠处吸收增加显著，这可能是因为脂质纳米粒可增加EV 的淋巴运输，而结肠处存在大量淋巴液［9］。药代动力学特性表明，ELN 有效促进了EV的体内吸收，显著提高了EV 的生物利用度。本研究为提高难溶性天然药物的理化性质改善提供了依据，为难溶性天然药物的临床应用奠定了基础。