细胞培养条件探讨

戴志亮 刘贤旭 张 君

（广东科贸职业学院，广东广州 510430）

大部分生物产品是从细胞培养生成，所以一定程度来说细胞培养技术是生物技术中最基础和较为核心的技术[1]。本文对细胞培养的基本条件、冻存与细胞复苏和细胞培养简单进行一个探讨。

1 细胞培养的基本条件

1.1 无菌设计与无菌操作

1.1.1 实验室设计及设备

细胞培养室的设计原则是防止微生物污染和有害因素干扰，要求空气清新、干燥、无尘烟。一般无菌操作区设在走动较少的内侧，常规操作和封闭培养于一室，洗刷消毒在另外一室。需要设置区域有：更衣间、缓冲间、操作间。其中操作间放置超净工作台、倒置显微镜、离心机、二氧化碳培养箱、电冰箱、放置无菌物品的架子等[2]。

1.1.2 无菌操作

主要分为三个部分：工作环境维护，细胞培养用的玻璃制品的处理，培养液及培养细胞的处理。

工作环境维护包括：实验前超净工作台打开紫外灯照射30min灭菌；进入超净工作台的物品要用75% 酒精喷洒，擦拭，即可，每次只能处理一种细胞，以免造成交叉感染；实验结束后要将细胞器皿清理出台面，然后用酒精擦拭台面。必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通；操作时切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验；工作人员必须穿戴实验服与手套后才进行实验；定期检查C02钢瓶内的C02压力；C02培养箱内的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜，预滤网；玻璃制品的处理：在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗并做好消毒工作。

培养液及培养细胞的处理：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水；胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。在pH为8.0、温度为37 °C时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

1.2 温度及气体条件

1.2.1 温度的影响

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度，不同种类的细胞对培养温度要求也不同。哺乳动物细胞培养的标准温度为36.5°C±0.5°C，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；哺乳动物细胞在39～40℃ 1h，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40～41℃1h，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41～42℃ 1h，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1h，细胞全部死亡[3-5]。

相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放入25～35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长，细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如-80℃或-196℃（液氮）长期保存。

1.2.2 气体条件需求

气体是哺乳动物细胞培养生存必须条件之一，所需气体主要有95% O2+ 5% CO2。适当的CO2是有利于细胞生长的，如果完全没有CO2，细胞也会像人一样出现醉氧的；CO2对细胞培养液中的PH值有着重要意义，CO2可以融入到培养液中，也可以从中释放，这取决于细胞的生长状态和环境变化，碳酸根离子也是常见的缓冲离子，对维持细胞稳定的生长环境至关重要。

2 细胞冻存与细胞复苏

2.1 细胞冻存

所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

从实际和效益的观点出发，液氮温度（-196℃）是目前最佳的冷冻保存温度。在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃下均可保存十年以上。目前应用较广的冷冻保护剂是DMSO，但在常温时对细胞毒害作用较大，因此在细胞复苏后及时洗涤冷冻保护剂。

操作方法如下：

2.1.1 待冷冻细胞悬液的制备

（1）按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；（2）将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；（3）向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；（4）按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；（5）再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

2.1.2 分级冷冻

（1）先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8°C），约40min；（2）接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10～-20℃），约30～60min；（3）将冻存管转入低温冰箱（-30℃），放置30min左右；（4）然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70～-80℃），过夜；（5）最后将冻存管投入液氮保存。

2.1.3 记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

2.2 细胞复苏

（1）调配37～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37～40℃；（2）从液氮中取出冻存管，立即投入37～40℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

3 细胞培养方法

3.1 一般体细胞培养方法

其传代程序为：（1）吸除旧培养液注入另瓶中；（2）用温PBS冲洗2～3次；（3）用0.25%温胰蛋白酶置37℃消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可：作用1～5min；（4）待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；（5）加入培养液后，用玻璃吸管轻轻反复吹打制成单个细胞悬液，应避免吹出气泡；（6）按所需比例比例接种到新培养皿于37℃培养。

3.2 悬浮培养法

某些细胞要求悬浮培养，否则不能存活。举例High five 细胞：

（1）细胞计数，培养密度控制在0.8～1.0 106cells/ml以下，置于27°C培养箱中培养，摇床转速100～130rpm，每48h进行传代（正常速率为48h增长为5～7倍）。

（2）当密度大于0.8～1.0×106cells/ml，观察细胞状态是否健康良好，则可以一分为二，加入新鲜培养基至200ml刻度。

3 结论

细胞培养经过了长时间的摸索和实践，已经得到了进一步的完善和发展，随着生物科技的快速发展，如细胞杂交、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立，也都与细胞培养紧密联系在一起，还已经涉及到生物学、农业、环境保护等诸多领域[6]。细胞培养技术是基础中基础，是细胞培养及其延伸的各行各业各领域中不可或缺的一环节，想要更好的实验结果实验产品更加离不开基础的细胞培养技术操作原理。