动物疫病采样技术规范

1 范围

本规范规定了动物疫病检验的样品采集、采样前准备、废弃物处置、采样记录、运送等技术。本规范适用于四川省行政区域内动物疫病病原学、病理组织学、血清学、免疫学等实验室检验所需样品的采集。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 16569-1996 畜禽产品消毒规范

GB/T 18635-2002 动物防疫基本术语

GB/T 18935-2003 口蹄疫诊断技术

NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法

病死及病害动物无害化处理技术规范（农医发〔2017〕25号）

《中华人民共和国动物防疫法》

《病原微生物实验室生物安全管理条例》

《兽医实验室生物安全技术管理规范》

《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1 样品 取自动物或环境，拟通过检验反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。

3.2 病料 来自患病或可疑患病动物的被（待）检材料。

3.3 采集 通过一定的方法，按照特定的程序和要求，对样品进行收集、处理及整理的过程。

4 样品采集原则

4.1 先排除后采样 凡发现急性死亡的动物，怀疑患有炭疽时，不得解剖。应先按NY/T 561-2015 中2.2 的规定采集血样，进行血液抹片镜检。确定不是炭疽后，方可解剖采样。

4.2 采集数量 进行流行病学调查、抗体监测、动物群体健康评估或环境卫生检测时，样品数量应满足生物统计学的要求。

4.3 采样时限 健康动物和濒临死亡动物根据样品采集需求及时采样；病死后的动物要立即采集样品，夏季不超过6 h，冬季不超过24 h。

4.4 无菌操作 采集过程中应该注意无菌操作，刀、剪、镊子、器皿、注射器、针头等采样用具应事先严格灭菌，每种样品应单独采集。

4.5 尽量减少应激和损害 活体动物采样时，应避免过度刺激或损害动物；也应避免对采样者的危害。

4.6 生物安全防护 采样人员应加强个人防护，严格遵守生物安全操作的相关规定，严防人兽共患病感染；同时应做好环境消毒及动物或组织的无害化处理，避免污染环境，防止疫病传播。

5 采样前准备

5.1 采样人员 采样人员应熟悉动物防疫的有关法律法规，具有一定的专业技术知识，熟练掌握采样工作程序和采样操作技术。采样前，应做好个人安全防护（穿戴手套、口罩、一次性防护服、鞋套等，遇到高风险传染病时戴护目镜或面罩），严格遵守生物安全操作的相关规定，避免对样品、环境的污染和对采样人员的伤害。

5.2 采样工具和器皿

5.2.1 应根据采集样品种类和数量的需要，选择不同的采样工具、器械及容器等，并进行适量包装。

5.2.2 金属器械可采用103 kPa 高压30 min，或160 ℃干烤2 h 灭菌、煮沸消毒30 min。临用时75%酒精拭擦，或用时进行火焰消毒。

5.2.3 器皿（玻制、陶制等）经高压、干热灭菌（同5.2.2），或经0.5%～1%碳酸氢钠水中煮沸10～15 min，再用无菌纱布擦干，无菌保存备用。

5.3 保存液 应根据所采样品的种类和要求，准备不同类型并分装成适量的保存液，如PBS 缓冲液、30%甘油磷酸盐缓冲液、灭菌肉汤和运输培养基等。

5.4 采集样品种类

5.4.1 根据不同的检验要求进行样品采集，采取包括相应的组织器官、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。

5.4.2 结合流行病学特点、临床症状和剖检变化，根据疫病的特点和需采取的检查方法，采集相关部位的病料。口蹄疫监测，可取水疱皮和水疱液检查，屠宰后采取淋巴结、脊髓或肌肉等；结核病监测可采取痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便等，死畜可采取淋巴结或其他组织；禽流感监测，可取咽拭子或泄殖腔拭子和血清样品。

5.4.3 无法估计病因时，可对组织器官、分泌物和排泄物进行系统全面的采集。

6 样品采集

6.1 血样

6.1.1 采血部位 根据动物种类确定采血部位。牛、马、羊常采用颈静脉、尾静脉；猪常采用耳静脉、前腔静脉、尾静脉；毛皮动物小量采血穿刺耳尖或廓外静脉，多量采血在颈静脉采集，或用划破趾垫0.5 cm 深度、剪断尾尖部采血。啮齿类动物尾尖采血，或眼窝血管丛采血。兔耳背静脉、颈静脉或心脏采血。禽类翅静脉采血，或心脏采血，鸭采用跖内侧静脉采血。

6.1.2 血液样品的处理

6.1.2.1 全血 样品容器中需加入0.1%肝素钠或阿氏液或枸橼酸钠（3.8%～4%的枸橼酸钠0.1 mL，可抗1 mL 血液）或乙二胺四乙酸（EDTA，PCR 检测血样的首选抗凝剂）等抗凝剂，采血后充分混匀。

6.1.2.2 脱纤血 应将血液置入装有玻璃珠的容器内，反复振荡，待纤维蛋白凝固后，即可制成脱纤血样品，经密封后贴上标签，以冷藏状态立即送实验室。

6.1.2.3 血清 将血样在室温下倾斜30°静止2～4 h，待血液凝固，有血清析出时，无菌剥离血凝块，然后置4 ℃冰箱过夜，待大部分血清析出后，分离血清，必要时可低速离心（1 000 g，10～15 min）分离血清，若需长时间保存，则将血清置-20 ℃以下保存，但要尽量减少反复冻融。

6.1.2.4 血浆 应在样品容器内先加入抗凝剂（见6.1.2.1），血液采集完后，将血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待红细胞自然下沉或离心沉淀后，轻轻吸取上层血浆。

6.2 组织样品

6.2.1 病原学检测样品 用常规解剖器械剥离动物的皮肤，体腔用消毒器械剥开，所需样品按无菌操作方法采集。做病原分离用，如进行细菌、病毒、原虫等病原分离所用的组织块的采集，均用新消毒的器械切取所需器官的组织块，每个组织单独放在已消毒处理的容器中，注明采样动物、日期、组织名称，防止相互污染。

6.2.2 组织病理学检查样品 采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放入不低于10倍于组织块的10%的中性福尔马林溶液中固定，固定时间一般为16～24 h。组织厚度不超过0.5 cm，长宽不超过1.5 cm×1.5 cm大小（检查狂犬病则需要较大组织块）。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如做冰冻切片，则将组织放在0～4 ℃容器中，送往实验室检验。

6.2.3 皮肤样品 有水泡或皮肤病变疾病的动物，应直接从病变部位采集。病变皮肤的碎屑、未破裂水泡液、水泡皮作为样品。

6.2.4 肠内容物和粪样 肠道只需选择病变最明显的部分，将其中的内容物弃去，用生理盐水轻轻冲洗；无菌截取肠道组织，置于灭菌容器或塑料袋中送检。取肠道内容物时，应烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔中吸取内容物，将肠内容物放在盛有灭菌的30%甘油生理盐水缓冲液中保存送检。或将带有内容物的肠管两端结扎，从两端剪断送检。

取粪便时应将消毒拭子插入动物肛门或泄殖腔中，旋转2～3 圈刮取直肠粘液或粪便，放入装有30%甘油磷酸盐缓冲液或者半固体培养基中送检，若检查消化系统寄生虫，则需采取适量新鲜粪便。

6.2.5 体液样品

6.2.5.1 乳汁、精液及尿液 用消毒水清洗乳头周边及乳头，并把乳房附近的毛刷湿，弃去3～4把奶液后进行采集，采集的奶液装于无菌试管中。精液样品易用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采集。所采样品应包括“富精”部分，盛装于无菌试管中，避免防腐剂污染。在动物排尿时，用洁净的容器直接接取中段尿液，也可使用自封袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液，采集尿液应早晨进行。

6.2.5.2 子宫阴道内分泌物或外生殖器包皮内分泌物的采集 将消毒好的特制吸管插入子宫颈口或阴道内，向内注射少量营养液或生理盐水，用吸球反复抽吸几次后吸出液体，注入培养液中。用软胶管插入公畜的包皮内，向内注射少量的营养液或生理盐水，多次揉搓，使液体充分冲洗包皮内壁，收集冲洗液注入无菌容器中。

6.2.5.3 胃液及呼吸道分泌物 胃液可用多孔的胃管抽取，将胃管送入胃内，其外端接在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即可自动流出。反刍动物在反刍时，当食团从食道逆入口腔时，立即开口拉住舌头，伸入口腔即可取出少量的瘤胃内容物。呼吸道可用灭菌棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分泌物，然后将拭子浸入保存液中，密封低温保存。常用的保存液有pH 7.2～pH 7.4 的灭菌肉汤或磷酸盐缓冲液盐水。如准备将待检样本接种组织培养，则保存于含0.5%乳蛋白水解物的汉克氏液中，一般每只拭子需保存液5 mL。

6.2.5.4 脑、脊髓液 颈椎穿刺法：穿刺点为环枢孔，将动物实施站立或横卧保定，使其头部向前下方屈曲，术部经剪毛消毒后，穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入，将针体刺入蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑脊液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器中。大型动物颈部穿刺一次采集量为35～70 mL。

腰椎穿刺法：穿刺部位为腰荐孔，将动物站立保定，术部经剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺入，当刺入蛛网膜下腔时，即有脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取，装入消毒容器中。大型动物腰椎穿刺一次采集量为15～30 mL。

6.2.5.5 其他液体 采集胆汁、脓、黏液和关节液等样品时，用烫烙法消毒采集部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入，吸取内部液体病料注入灭菌的试管中，塞好棉塞送检。也可用接种环经消毒后的部位插入，提取病料直接接种到培养基或涂布到玻片上。

6.2.6 胚胎及胎儿 选取无腐败的胚胎、胎儿或胎儿的实质器官，装入适宜容器内立即送检。如果在24 h 内不能将样品送达实验室，应冷冻运送。

6.2.7 脑、脊髓 将采集的脑、脊髓浸入30%甘油生理盐水等保存液中送检，或根据要求送检。

6.3 其他

6.3.1 对于重大动物疫病如新城疫、口蹄疫、禽流感、猪瘟、高致病性蓝耳病的样品采集按照国家相关标准执行。

6.3.2 监测环境卫生或调查疾病，可从遗弃物、通风管、下水道、孵化场或屠宰场采集有代表性的样品。

7 样品包装及采样现场废弃物处理

7.1 样品包装

7.1.1 禽流感、口蹄疫、猪瘟、高致病性蓝耳病、新城疫等重大动物疫病采样按照《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》执行。

7.1.2 每个组织样品应仔细分别包装，在样品袋或平皿外贴上标签，做好标记，注明样品名、样品编号和采样日期等，再将样品分类包装。

7.1.3 拭子样品的小塑料离心管应放在规定离心管塑料盒内。

7.1.4 血清样品装于小瓶时应用铝盒或塑料盒盛放，盒内加填塞物避免小瓶晃动。若装于小塑料离心管中，则应置于离心管塑料盒内。

7.1.5 样品外包装须贴上封条，封条上应有采样人的签章，并应注明贴封日期、标注放置方向。

7.2 采样现场废弃物处理

7.2.1 采样使用过的器械，如一次性器械应进行生物安全无害化处理；可重复使用的器械应先消毒后清洗再消毒后才能使用，检查过疑似牛羊海绵状脑病的器械要放在2 mol/L 的氢氧化钠溶液中浸泡2 h以上，才可再次使用。

7.2.2 采样产生的其他废弃物、剩余组织和动物尸体处置应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行无害化处理。

8 样品记录

8.1 每份样品均须贴上标签，并注明采样时间、地点、名称、送检编号。

8.2 送往实验室的样品应有一式二份的送检单，一份随样品送实验室，一份备案。样品记录内容包括：动物场（户）地址、饲养动物种类、品种、数量、年龄、发病日期及分布、临床症状、治疗用药、饲料种类、产蛋产奶记录、送检清单及说明、进行何种检验、畜主姓名、地址、电话、送检人、地址及联系、送检日期等。

8.3 采集样品时同时记录首发病例和继发病例日期及造成的损失、感染动物在畜群中的分布情况、动物场（户）的存栏数、死亡动物数、出现临床症状的动物数量及其日龄、动物的免疫和用药情况等，随样品送达实验室。

9 样品保存

9.1 采集的样品在无法于12 h内送检的情况下，根据不同的检验要求，应将样品按所需温度分类保存于不同冰箱、冰柜中。

9.2 血清放-20 ℃冻存，全血暂时放4 ℃冰箱保存。

9.3 供细菌检验的样品应4 ℃保存，或可用灭菌后的30%～50%的甘油生理盐水保存。

9.4 供病毒检验的样品应在0 ℃以下低温保存，也可以用灭菌后的30%～50%灭菌甘油生理盐水0 ℃以下低温保存。

9.5 采集的样品应立即送检，无法达到检测要求的样品作无害化处理，按照GB 16548、《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《兽医实验室生物安全技术管理规范》执行。

10 样品运送

10.1 所采集的样品以最快最直接的方式送往实验室。如果样品能在24 h 内送达，则可存放于4 ℃左右的保温容器中运送，容器内加垫缓冲材料防止破裂。保温容器应密封，防止渗漏，保温容器外贴上封条。封条有贴封人（单位）签字（盖章），并注明帖封日期。

10.2 制成的涂片、触片、玻片上注明编号，并另附说明。玻片应放入专门的病理切片盒内，在保证不被压碎的条件下运送。

10.3 航空运输的样品参照相关航空管理条例执行。