饲粮中霉菌毒素快速检测技术研究现状及发展方向

李笑樱，孙铁虎，郭 杰，陈 博，佟 毅，潘喜春

（1.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209；2.吉林中粮生化有限公司（玉米深加工国家工程研究中心），长春 130033；3.中粮集团中粮生化专业化平台，北京 100005）

真菌毒素是真菌在适宜温湿度条件和基质中产生的具有生物活性的次级代谢产物，在粮食及饲料卫生学领域又称为霉菌毒素[1]。目前已知的霉菌毒素有300多种，其中污染范围较广、毒性较大的主要有黄曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）、赭曲霉毒素（OTA）、伏马菌素及T2毒素等。据联合国粮食及农业组织（FAO）估算，全世界每年约有25%的谷物受霉菌毒素污染，约2%的农产品因霉变而失去营养和经济价值，给农业带来严重的经济损失[2]。被霉菌污染的饲料和粮食颜色、气味发生改变，脂肪变质，适口性变差，因而动物的采食量下降，影响生长性能；霉菌毒素还会引起动物繁殖功能紊乱，造成繁殖性能降低；降低免疫细胞活性，导致免疫抑制；还可抑制蛋白质和酶的合成，破坏组织细胞结构，损害动物的肝肾、肠道、神经等器官和组织[3-7]。霉菌毒素在动物产品中（如肉蛋奶中）也会有一定残留，再通过食物链对人体造成危害。因此，早期对饲料及食品中的霉菌毒素进行监控和防治，从而降低霉菌毒素对畜牧业的危害、减少经济损失，对保障消费者身体健康和国家粮食食品安全意义深远。我国《饲料卫生标准》（GB 13078-2017）和《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017）对饲料及原料和食品中各霉菌毒素的最大允许量都制定了严格的限制标准。

1 霉菌毒素的检测方法

霉菌毒素的现有检测方法主要有两大类：确认方法和快速方法。确认方法又叫仪器方法，主要基于理化仪器设备，如薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和各种联用技术，如气质联用（GC-MS）、液质联用（HPLC-MS）等。仪器分析法因其灵敏度高、结果准确可靠而受到检测机构的青睐，并作为霉菌毒素的常用确证检测方法。但这种方法需要较为昂贵的精密设备，配备专业的实验操作人员，且检测样本成本高、样品前处理复杂、操作步骤烦琐，无法满足基层单位对批量样品的快速筛查检测的需求。同时，随着经济发展，粮油食品及饲料相关的贸易流通业务日益频繁，各级质量控制部门对于样品检测的压力也越来越大，这就要求对霉菌毒素检测向快捷准确方向发展[8-9]。

2 霉菌毒素快速检测方法

现在较多的快速检测方法主要基于免疫化学，包括酶联免疫吸附法（ELlSA）和免疫层析方法。酶联免疫吸附法（ELlSA）的基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体上，再用做好标记的酶与底物反应显色，以此来判断是否有相应的免疫反应[10]。该法的优点是免疫反应特异性强、灵敏度较高、样品预处理简便，通过酶标仪读取检测结果准确且稳定，现已成为最常见的快速检测饲料和食品中霉菌毒素的方法。

免疫层析法主要通过免疫层析试纸条进行检测，免疫层析试纸条主要由样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫及黏性底板等部分组成。试纸条上NC膜固定有测试线和质控线；样品溶液加入至样本垫，预先在结合垫上喷涂抗体标记物，样品溶液通过毛细作用在层析试纸条上移动，经过检测线时会发生特异性免疫反应，而游离的抗体标记物进一步与质控线发生免疫反应，已着色的标记物在短时间（5～10 min）便可显示出结果；测试线的显色深浅或吸光度大小进行定性或半定量判定，检测结果往往存在一定误差。

市面上的免疫层析试纸条标记物材料依据光谱特性的不同可分为两类：一类是吸收光谱型材料，包括胶体金、胶体碳、磁珠等；另一类是发射光谱型材料，包括量子点及量子点微球、荧光微球以及上转换磷光纳米粒子等，其中胶体金免疫层析法应用较为普遍[8]。胶体金免疫层析法是以胶体金作为示踪标志物，利用抗原抗体反应发明的一种免疫标记技术。胶体金是由氯金酸水溶液在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，颗粒之间因静电作用形成一种稳定的金溶胶状态。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质或其他多种生物大分子物质（如霉菌毒素、抗生素、激素、核酸、多肽缀合物等）的正电荷基团的静电吸引而形成牢固的结合，这种结合对所标记物质的生物活性却无显著影响[11]。

由于霉菌毒素属半抗原，不具有免疫原性，因此在制备抗体前首先要合成霉菌毒素—载体蛋白结合物免疫原。由于各种霉菌毒素分子结构不同，其在绝大部分情况下不具备连接反应基因，因此霉菌毒素分子首先要经过衍生过程，而衍生所需要一定的连接化学反应条件，这种反应条件一定不能导致其半抗原分子结构发生改变，之后再通过连接物与载体蛋白连接[11]。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）和卵清蛋白（OVA）等。制备好的半抗原结合物在免疫动物前，要测定结合物中半抗原数目，因为结合物中半抗原分子数目太多或太少，都会导致诱发抗体的能力较差。

基于胶体金为标记材料的免疫层析法生产的霉菌毒素检测试纸条是目前应用最广泛的一种快速检测产品，并已大量应用于AFB1、ZEN、DON以及OTA等霉菌毒素的快速检测。且该技术由于无需精密仪器、方法简单快速、成本低廉等优点，适用于饲料和粮食现场快检和大规模样品筛查，现已被广泛应用[12-14]。

3 霉菌毒素胶体金快速检测方法在实际中的应用

姚佳等以AFB1、DON和ZEN分析了3种毒素胶体金免疫层析快速检测试纸条的最低检出限分别为0.005、0.5和0.3 mg·kg-1，通过回收率和变异系数评价了该快检方法的准确性和精密度，并进一步将该检测技术应用于宁夏稻米毒素的快速检测，结果表明，3种毒素的胶体金免疫层析快速检测试纸条具有较高灵敏度和特异性，并可通过肉眼直接判读结果的特性，适用于稻米的现场快速检测[15]。孙清研究了一种可直接检测油中AFB1的免疫层析方法，其按一定比例混合植物油和纯净水，用免疫层析试纸条检测，可通过肉眼确认油中的AFB1含量，该方法最低检测限可达1.5 μg·kg-1，与国标法对比其准确性相对较高[16]。该方法不仅可用于实验室中粮油AFB1检测，也可用于家庭中植物油安全检测。由于近几年食品安全事件频发，牛奶中黄曲霉毒素的快速检测成为了关注的重点。Wang等研制出一种用于检测乳及乳制品中的AFM1的纳米金免疫层析试纸条，用该试纸条检测了15种乳及乳制品中AFM1含量，所需时间仅10 min，检测限为0.028 ng·mL-1，并检测出其中6种乳及乳制品受到轻微的AFM1污染，发现所有样品中AFM1含量均＜1 ng·mL-1[17]。

以上列举应用多为定性检测，这些检测因肉眼观察主观性较强，检测结果重复性也相对较差。近年来随着各种技术手段综合应用，多学科之间交叉渗透，胶体金层析快速检测技术也有了较大的改进和提高。

王海彬成功研制出黄曲霉毒素胶体金免疫层析速测仪，该速测仪结合光、机、电、计算机等技术手段，胶体金免疫层析试纸条作为一级传感器，面阵CMOS图像芯片作为二级传感器，将黄曲霉毒素免疫层析快速检测试纸条的定性结果进行快速量化读取，获取待检测黄曲霉毒素的定量信息，从而对黄曲霉毒素进行快速定量检测，检测花生样品结果表明，加标回收率为88%～119%，相对标准偏差（RSD）分布为6%～27%，快速定量检测结果与高效液相色谱法比对后发现两种方法相对误差≤17%，同时还建立了花生中黄曲霉毒素总量（B1+B2+G1+G2）的快速定量检测技术[18]。张兆城等研发了花生、玉米、大米、小麦等粮油农产品中黄曲霉毒素总量、AFM1和AFB1高灵敏、高特异性系列检测技术，同时研制了系列配套试纸条和黄曲霉毒素单光谱成像检测仪和黄曲霉毒素流动滞后免疫时间分辨荧光检测仪[19]。王督等研发的检测花生、玉米、大米、小麦等粮油农产品中黄曲霉毒素B1的定量分析方法，检测结果表明，4种样品检测的线性范围为1.0～20.0 μg·kg-1，r2＞0.97，方法的定量限为1.0 μg·kg-1，样品加标回收率为75%～106%，RSD＜20%，且此法与免疫亲和柱净化-HPLC法相比，相对误差＜15%，样品检测时间只需15 min，检测成本也低于其他方法[12]。

王莹等通过合成玉米赤霉烯酮（ZEN）人工抗原，制备抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体（mAb），并以此为基础建立胶体金免疫层析检测试纸，与胶体金读数仪配合使用，用于快速定量检测玉米和小麦样品中ZEN，结果表明，检测的玉米和小麦样品，ZEN的检测限为4.7 μg·kg-1，定量限13.9 μg·kg-1，线性范围 14.5～500 μg·kg-1，相关系数 r=0.996 4，用高效液相色谱法进行比对，发现快检方法检测样品的准确度为80.1%～149.7%，变异系数范围7.3%～19.6%，并用配对t检验分析，表明两种方法之间无显著性差异[20]。宋青龙等应用胶体金免疫层析技术和定量读数仪技术研制出一种快速定量检测谷物和饲料中AFB1含量的胶体金快速定量检测试剂盒，该试剂盒以胶体金标记高特异性单抗，与偶联抗原进行正交试验，确定适宜条件，同时通过与对照线和试验线的颜色对比，应用胶体金定量读数仪，对样本中黄曲霉毒素B1含量进行定量检测，结果表明，黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测方法便捷、稳定，检测结果可定量，避免了人眼判别的差异，且与常见霉菌毒素无交叉反应，样品检测结果与高效液相色谱法检测结果的相对误差＜20%[21]。

对市面上几款胶体金免疫层析产品进行调研，发现这些产品大多也有配套的分析检测仪，仪器中有样品检测标准曲线，可快速读取检测样品中霉菌毒素含量。检测样本量没有特殊要求，既可检测单个或少量样本，也可检测大量样本。可检测基质成分较为单一的原料样品（如粮食、油料、饲料原料等）也可检测基质成分较为复杂的样本（如酒糟、粮食发酵产品、成品饲料等），前处理过程安全快捷，无需对检测提取液进行pH调节，可用于实验室霉菌毒素快速检测。另外，配套的定量检测仪器可通过网络自动进行标准曲线读取、数据传输、软件升级、问题故障诊断、质量控制等。对使用这些快检产品的客户进行调研，发现这些快检产品在实际应用中存在一些缺陷；胶体金层析试纸条生产厂家生产过程质控不严，读数仪对快检卡颜色深浅不敏感导致检测结果偏差较大，检测环节和快检卡本身受检测环境温度湿度影响较大，没有配套完善的仪器确认方法，数据溯源上传功能故障频发，检测卡成本过高等，问题还有待解决。

4小 结

免疫层析试纸条因操作步骤简便、检测快速、无需昂贵大型仪器等特点，在批量样品的快速筛查方面具有极大的优势和广阔的应用前景，已广泛应用于粮油及饲料中霉菌毒素的快速检测[22]。随着其他新型标记材料的应用，今后将会进一步提高免疫层析方法的检测准确性和精确性。另外，霉菌毒素在粮油和饲料中通常多种共存，建立对多种毒素的快速、高通量检测技术，将大大节约成本，提高检测效率，因此基于免疫层析平台的多种毒素检测技术也必将成为今后的发展方向之一。霉菌毒素除了在粮食和饲料中存在以外，在其他食品饮品领域（如发酵类食品、茶叶、菌糠等）同时存在安全隐患，未来对这些领域中霉菌毒素的检测也应该得到重视[23]。各级卫生部门和食品安全管理部门应重视霉菌毒素的风险评估和监测预警等工作，建立霉菌毒素快速检测标准。相关管理部门应预防严控食品的来源、加工、销售等环节，精准掌握其中霉菌毒素数据信息，综合管控治理。同时引导帮助广大消费者树立食品安全意识和正确解读国家相关标准法规，引导消费者购买安全、健康、绿色的食品[24]。