肉桂醇脱氢酶基因研究进展及其在小麦抗倒伏中的应用

卢雯瑩 崔贺云 高杉 崔顺梅 吴营照

摘    要：小麦（Triticum aestivuml）是世界上广泛种植的粮食作物，在逐渐提高小麦产量的同时，高产与倒伏之间的矛盾问题日益显现。木质素是一种酚类多聚体，它是维管植物细胞壁中不可忽视的重要成分，其在植物中的含量与茎秆是否具有抗倒伏性以及抗倒伏的强弱密切相关。肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素单体合成途径下游的一个关键酶，大部分植株木质素的总含量会在CAD活性降低或受抑制时随之降低。本文综述了肉桂醇脱氢酶基因及其在小麦抗倒伏中的研究进展，有望对小麦肉桂醇脱氢酶基因的克隆表达分析及其对小麦抗倒伏的影响作用奠定基础。

关键词：肉桂醇脱氢酶;木质素;小麦;抗倒伏

中图分类号：S512.1          文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.10.002

Research Progress of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Gene and Its Application in Lodging Resistance in Wheat

LU Wenying1， CUI Heyun2， GAO Shan1， CUI Shunmei3， WU Yingzhao3

（1.Luohe Academy of  Agricultural Science， Luohe， Henan 462300，China; 2.Luohe Agricultural and Rural Bureau， Luohe，Henan 462300，China;3.Golden Autumn Seed Industry Limited company of Luohe， Luohe，Henan 462300，China）

Abstract： Wheat （Triticum aestivuml） is a widely cultivated crop in the world. The production of wheat is highly increasing in recent years. However， high yield in wheat often causes lodging. Lignin is a phenolic polymer. It is an important component of vascular plant cell walls， and its content in plants is closely related to lodging resistance. Cinnamol alcohol dehydrogenase （CAD） is a key enzyme of downstream about lignin monomer synthesis pathway. The total lignin content of most plants will decrease with CAD activity decreased or inhibited. This paper reviewed the effects of CAD gene on lodging resistance of wheat. It may help the cloning and expression analysis of CAD gene and its further impacts on wheat lodging resistance in the future.

Key words： Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase; Lignin; Triticum aestivuml; anti-lodging

小麦是一年生禾本科作物，在世界范围内广泛种植，随着栽培技术的不断改进、分子辅助育种技术的不断发展，小麦生产水平逐渐提高。然而，高产和倒伏之间的矛盾也逐渐凸显。小麦在籽粒灌浆以后的一段时期容易发生倒伏，倒伏一旦发生，将大大影响小麦产量，一般情况下会导致小麦减产达到10%～30%，严重倒伏的可能减产80% 以上[1]。因此，解决小麦的倒伏问题是当前研究小麦品质的重要方向。

木质素与纤维素、半纤维素一起构成次生壁。多位学者的研究表明，植株茎秆强度与相应的木质素含量之间有显著的正相关关系。因此，通过促进木质素总量的提升或改变木质素单体结构的构成可以提升茎秆抗折力。

木质素的合成路径较为复杂。在这个合成过程中涉及很多关键酶基因和转录因子的调控机制。本文选取了木质素单体合成下游中关键的还原酶，即肉桂醇脱氢酶（CAD）进行相关论述分析。CAD 在NADP辅酶的作用下将5种肉桂醇（香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羟基松柏醛、芥子醛）还原成相对应的醇（香豆醇、咖啡醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）。已有研究表明，抑制CAD的活性会降低木质素含量或改变木质素单体结构。

1 肉桂醇脱氢酶基因的结构特征

CAD是醇脱氢酶蛋白，具有两个保守的结构域：一是醇脱氢酶GroES-like结构域（Alcohol dehydrogenase GroES-like domain），它是CAD酶的活性中心，包括与锌结合的催化位点和結构位点，而这一结构也是醇脱氢酶家族中所共有的结构;二是Rossmann折叠辅酶结合结构域。除此之外，这个家族中有一个能与底物特异性结合的底物结构域[2]。

在被子植物中，CAD基因在植物生长发育的不同阶段由多基因家族编码而发挥不同作用，这些CAD基因相似性比较高，因此对单个基因功能的鉴定比较困难。高粱CAD6和水稻CAD6在C端都有一个过氧化物体定位信号肽SKL，这在植物中是普遍存在的[3]。水稻的12个CAD基因和桉树CAD2在NAD（P）/NAD（P）H结构域上存在保守的Ser-212。此外，水稻的CAD2中存在保守的Trp-119和Phe-298[4]，这些证据表明CAD基因在物种进化过程中保持稳定性。马庆虎等[5]从小麦中分离出一条编码CAD基因的cDNA，并从小麦EST数据库中得到其他10个CAD类似基因，连续命名为TaCAD2-TaCAD11。他的研究认为：TaCAD1基因属于真正的基因家族并参与木质素合成，TaCAD2 和TaCAD4也属于这一家族，但由于缺乏C末端结构域因而被认为是假基因。TaCAD1的三维结构预测图与AtCAD5相似，但是在底物结合区域有两个氨基酸被替换。

2 肉桂醇脱氢酶基因的家族和分类

由于核苷酸和氨基酸序列之间存在差异因而可将CAD基因分成三种类型，其中只有一种类型参与了木质素的生物合成并发挥重要作用，这一类型的CAD在NADP辅酶的作用下将肉桂醇（香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羟基松柏醛、芥子醛）还原成相对应的醇（香豆醇、咖啡醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）;尚未发现另外两种CAD类型在木质素合成中发挥作用，有可能是第一种类型的假基因或是参与了其他代谢活动[6]。

许多学者的研究均表明CAD基因是以基因家族的形式存在的，但是CAD基因功能各不相同，有的CAD基因参与木质素生物合成，有的CAD基因与发挥主要作用的CAD基因互相补充共同作用，还有的CAD基因并不发挥任何作用。植物中一些已经被克隆和已研究清楚的CAD基因家族情况如表1所示。

3 肉桂醇脱氢酶基因的研究进展

3.1 肉桂醇脱氢酶基因的克隆

NCBI网站上已经注册的完整的CAD基因的mRNA有200条左右，包括拟南芥、水稻、小麦、棉花、高粱、毛白杨和茶树等等。虽然不同种属的CAD基因家族各有不同，但是在CAD基因系统进化上还具有一定的保守性。NCBI中很多是CAD类似基因，与真正的CAD基因同源性并不是很高，其蛋白结构、酶学特征也没有完全揭示。

3.2 肉桂醇脱氢酶在木质素合成中的调控

前人研究表明，通过CAD基因的正义和反义表达以及突变体的发生来调整木质素的总含量及木质素单体的比例，目前在杨树、松树、高粱、水稻和玉米等植物中均有研究。大部分植株在CAD活性受到抑制时，木质素的总含量会降低;还有一部分木质素总量不发生变化但木质素单体的结构发生改变或发生其他情况的变化，具体见表2。

3.3 肉桂醇脱氢酶基因在转录水平上的研究

以上论述已经表明在不同品种植株中CAD基因的功能各不相同，即使在同一植株中，不同的器官、组织和不同的生育时期其表达量也不尽相同。

杨树CAD基因家族中有19个CAD基因，按照其表达模式的不同可以分成三类：一类在韧皮部、木质部高度表达，二类在根部高度表达，三类在根和顶芽中高度表达。除了表达部位不同外，一二类表达量随时间推移不断增加而三类在夏季和秋季的表达量明显高于春季和冬季[16]。

通过实时荧光定量PCR实验对拟南芥的9个CAD基因进行表达研究，其中AtCAD2和AtCAD3在木质部中并没有荧光信号，但是在其根冠和分生组织有表达。AtCAD4和AtCAD5在根中高度表达。此外，AtCAD在花中是高度表达，但在茎中表达量较低[17]。

对小麦TaCAD1基因的功能分析发现，小麦TaCAD1基因在茎秆中高度表达，在叶片中有微量的表达而在根中几乎不表达，并且与不抗倒伏的品种C6001相比，抗倒伏品种H4564的mRNA表达丰度、蛋白水平和酶活性水平都明显较高[5]。

不仅如此，CAD基因还与植株生长发育时期相关。枇杷和绿梅在果实不断成熟的过程中，枇杷EjCAD1和绿梅肉桂醇脱氢酶Pm15的活性和表达量都是在不断增加的[18]。

3.4 肉桂醇脱氢酶基因的启动子分析

启动子是基因的一个构成元件，CAD基因的启动子可以控制CAD基因什么时候表达，也可以控制CAD基因的表达程度。杨树中PoptrCAD基因的启动子有多个组成部分，在白杨不同的生育时期、不同器官和组织中有不同的组分参与调控PoptrCAD基因的表达。同时，在遇到干旱、洪涝、病虫害等因素胁迫时，该基因可以与Myb、锌指蛋白等调控因子结合，也可以和ABA、生長素等信号分子结合共同产生应答机制[19]。在甘薯的启动子研究中也得出类似结论：出现外界作用时，甘薯IbCAD1的启动子会有明显的响应机制[20]。

4 肉桂醇脱氢酶基因对小麦抗倒伏性影响的展望

茎倒伏是小麦发生倒伏的主要位置，也是小麦实现高产的主要威胁因素[21]。木质素通过自身交织来使细胞壁加厚，能起到良好的抗压作用[22]。木质素合成的路径比较复杂，有很多因素参与调控木质素的合成。在木质素的整个合成过程中参与调控的基因包括苯丙氨酸解氨酶基因（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（cinnamate acid-4-hydroxylase，C4H）、香豆酸-3-羟化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）、咖啡酸O-甲基转移酶基因（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT）、咖啡酰辅甲基转移酶A-O酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase， CCoAOMT）、4-香豆酸：辅酶A连接酶（The 4-coumarate： coenzyme A ligase，4CL）、肉桂酰辅酶A 还原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）、CAD基因等。肉桂醇脱氢酶基因在催化木质素合成途径中，于木质素单体生物合成的最终步骤发挥作用，这决定了其是不可或缺的关键酶之一，其结构和生物学特性的分析将会对小麦抗倒伏性的研究提供理论基础。

目前，已知的参与植物抗逆的转录因子研究成为增强植物抗逆性的重要方向之一，加之分子生物技术已相对成熟，我们可以根据已有的研究基础，对肉桂醇脱氢酶基因进行生物信息学分析，结合转录组数据及ChIP-seq分析，挖掘肉桂醇脱氢酶基因上游调控因子。在大数据背景支持下分析新的与小麦肉桂醇脱氢酶基因共同参与小麦抗倒伏的机制，尝试是否能够在某些与木质素合成相关的基因片段等进行编辑处理，研究其相关功能。在基本清楚小麦肉桂醇脱氢酶基因参与木质素合成途径的作用机制的基础上，利用分子育种技术实现其在小麦抗倒伏中的应用，有利于培育品质更加优异的小麦品种。

参考文献：

[1]李崇德， 许华.小麦稳产高产限制因素与主要技术措施[J].农业技术与装备， 2010， 9（18）：50-51.

[2]SCHUBERT R， SPERISEN C， GERHARD M S， et al. The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene structure in Picea abies（L.） Karst.： genomic sequences， Southern hybridization， genetic analysis and phylogenetic relationships[J]. Trees （Berlin）， 1998， 12（8）：453-463.

[3]SABALLOS A， EJETA G， SANCHEZ E， et al. A genomewide analysis of the cinnamyl alcohol dehydrogenase family in sorghum[Sorghum bicolor（L.） Moench] identifies SbCAD2 as the brown midrib6 Gene[J]. Genetics， 2009， 181（2）：783-795.

[4]TOBIAS C M， CHOW E K. Structure of the cinnamyl-alcohol dehydrogenase gene family in rice and promoter activity of a member associated with lignification[J]. Planta， 2005， 220（5）：678-688.

[5]MA Q H. Functional analysis of a cinnamyl alcohol dehydrogenase involved in lignin biosynthesis in wheat[J]. Journal of Experimental Botany， 2010，61（10）： 2735-2744.

[6]胡文冉， 李曉东， 周小云，等. 棉花肉桂醇脱氢酶基因在棉纤维中的表达及对其结构组分的影响[J]. 西北植物学报， 2019， 39（6）：1114-1120.

[7]KIM S J， KIM M R， BEDGAR D L， et al. Functional reclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，

2004，101（6）：1455-1460.

[8]HIRANO K， AYA K， KONDO M， et al. OsCAD2 is the major CAD gene responsible for monolignol biosynthesis in rice culm[J]. Plant Cell Reports，2012，31（1）：91-101.

[9]FAN L， SHI W J， HU W R， et a1. Molecula rand biochemical evidence for phenylpropanoid synthesis and presence of wall-linked phenolics in cotton fibers[J]. Joumal of Integrative Plant Biology，2009，51 （7）：626-637.

[10]SATTLER S E， SAATHOFF A J， HAAS E J， et al. A nonsense mutation in a cinnamyl alcohol dehydrogenase gene is responsible for the sorghum brown midrib6 phenotype[J]. Plant Physiology，2009，150（2）：584-595.

[11]BARAKAT A， BAGNIEWSKA-ZADEORNA A， CHOI A， et al. The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family inPopulus： phylogeny， organization， and expression[J]. BMC Plant Biology， 2009， 9（1）：26.

[12]BAUCHER M， MONTIES B， MONTAGU M V， et al. Biosynthesis and Genetic Engineering of Lignin[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 1998，17（2）：125-197.

[13]JOURDES M， CARDENAS C L， LASKAR D D， et al. Plant cell walls are enfeebled when attempting to preserve native lignin configuration with poly-p-hydroxycinnamaldehydes：

Evolutionary implications[J]. Phytochemistry， 2007， 68（14）：1932-1956.

[14]HALPIN C， HOLT K， CHOJECKI J， et al. Brown-midrib maize （bm1）： a mutation affecting the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene[J]. Plant journal 1998，14（5）：545-553.

[15]PIQUEMA J， CHAMAYOU S， NADAUD I， et al. Down-regulation of caffeic acid O-methyltransferase in maize revisited using a transgenic approach[J]. Plant Physiology，2002， 130（4）：1675-1685.

[16]任珊珊， 赵艳玲， 白华， 等.杨树肉桂醇脱氢酶基因序列和表达模式分析及CAD4酶活性检测[J].华中农业大学学报， 2011， 30（5）：578-584.

[17]SIBOUT R， EUDES A， POLLET B， et a1. Expression pattern of two paralogs encoding cinnamyl alcohol dehydrogenases in Arabidopsis isolation and characterization of

the corresponding Mutants[J]. Plant Physiology，2003，132（2）：848-860.

[18]张鲁斌， 谷会， 弓德强， 等.植物肉桂醇脱氢酶及其基因研究进展[J].西北植物学报， 2011， 31（1）：204-211.

[19]GOICOECHEA M， LACOMBE E， LEGAY S， et al. Eg MYB2， a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem， regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis[J]. Plant Journal， 2005， 43（4）：553-567.

[20]KIM Y H， BAE J M， HUH G H. Transcriptional regulation of the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene from sweetpotato in response to plant developmental stage and environmental stress[J]. Plant  cell  reports， 2010， 29（7）：779-791.

[21]陳晓光， 史春余， 尹燕枰， 等.小麦茎秆木质素代谢及其与抗倒性的关系[J].作物学报， 2011， 37（9）：1616-1622.

[22]JONES L， ENNOS A R， TURNER S R. Cloning and characterization of irregular xylem4 （irx4）： A severely lignin-

deficient mutant of Arabidopsis[J]. The plant journal， 2001，26（2）： 205-216.

收稿日期：2020-06-16

作者简介：卢雯瑩（1994—），女，河南漯河人，研究实习员，硕士，主要从事植物分子生物学研究。