滇重楼稻曲拟盘多毛孢叶斑病病原鉴定及其生物学特性测定

何翔 李翱 李楚

摘要 為明确滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz一种新的叶斑病病原菌，以云南省丽江市玉龙纳西族自治县中药材种植基地内发现的一种新真菌性病害为供试研究材料，经单孢分离培养、形态特征观察、致病性测定、多基因系统发育分析（ITS、tub2、tef1）和生物学特性测定，对病原物进行分类鉴定。研究结果表明，病原物CL107形态符合Pestalotiopsis sp.种属典型特征;菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）与参比标准菌株P.oryzae CBS 353.69同源性分别为100.00%、100.00%、98.92%，可将稻曲拟盘多毛孢P.oryzae确定为滇重楼叶斑病病原物。生物学特性研究表明，PDA培养基、pH 8.0、28℃、全黑暗条件有利于菌株CL107菌丝生长和分生孢子形成，以葡萄糖为碳源有利于纯化菌株菌丝生长和产孢;以酵母提取物为氮源有利于纯化菌株菌丝生长，以牛肉膏为氮源有利于纯化菌株产孢。本研究首次报道稻曲拟盘多毛孢P.oryzae可侵染滇重楼植株，引起真菌性叶斑病，明确影响病害发生的环境因子，为该叶斑病的诊断与防治提供科学依据和理论指导。

关键词 滇重楼; 叶斑病; 稻曲拟盘多毛孢; 生物学特性

中图分类号： S 435.67

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019497

Abstract

In order to characterize a new fungal leaf spot disease of Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz， the fungal pathogens were isolated in a Chinese herbal medicine planting base in Yulong Naxi autonomous county， Lijiang， Yunnan. The pathogens were classified and identified based on single spore isolation culture， morphological observation， pathogenicity assay， multi-gene phylogenetic analysis （ITS， tub2， tef1） and biological characteristics. The results showed that the pathogen morphology of CL107 was consistent with the typical characteristics of Pestalotiopsis sp.; strains CL107-ITS （accession no. MK156295）， CL107-BT （accession no. MN015425）， CL107-EF1 （accession no. MN022941） and the reference standard strain P.oryzae CBS 353.69 shared a high homology of 100.00%， 100.00% and 98.92%， respectively. P.oryzae was the leaf spot disease pathogen of P.polyphylla var. yunnanensis. The biological characteristics of the strain CL107 was beneficial to mycelial growth and conidial formation in PDA medium at pH 8.0， 28℃， and under all dark conditions. The use of glucose as the C source was beneficial to the growth and sporulation of the purified strains. The yeast extract was used as the N source， which was beneficial to the mycelium growth of the purified strain， and the beef extract used as the N source could facilitate the sporulation of the purified strain. This study firstly reported that P.oryzae could infect P.polyphylla var. yunnanensis， which caused fungal leaf spot. The environmental factors affecting the occurrence of the disease were also identified， which would provide a scientific basis and theoretical support for the prevention and control of the leaf spot disease.

Key words Paris polyphylla var. yunnanensis; leaf spot disease; Pestalotiopsis oryzae; biological characteristics

滇重楼Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz，别名独角莲，多年生草本植物，具清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，是我国一种重要的传统药用植物，主要分布在云南、四川、贵州等地[1-2]。云南是我国药用植物资源种类最丰富的地区，也是滇重楼主要的种植区。近年来，由于长期的掠夺性采挖和飙升的药用需求量，使得野生滇重楼种质资源急剧减少，目前依靠人工种植满足市场需求[3]。随着滇重楼种植产业的不断发展，由于种植管理模式、自然气候条件等方面的不足，滇重楼各类病害问题日益凸显。据前人研究报道，云南省中药材种植区滇重楼病害种类主要有根腐病[4-5]、软腐病[6-7]、立枯病[8]、细菌性穿孔病[8]、白霉病[4，9]、褐斑病[9]、灰霉病[10]等; 由重楼柱隔孢Ramularia paris引起的白霉病和细链孢Alternaria tenuis 引起的褐斑病是目前已报道的两种滇重楼叶部病害。滇重楼叶斑病主要为害叶片，植株发病时叶片正面形成圆形、椭圆形或不规则的病斑，严重时感病植株叶片正面病斑连片，变褐枯黄甚至植株死亡，直接影响滇重楼的产量和品质，给种植户带来巨大的经济损失;同时叶斑病也成为大规模发展滇重楼种植业的潜在威胁，且此类病害的防治已成为生产中极为突出的问题。

近年来，关于Pestalotiopsis sp.种属的分类已有大量的研究报道，主要集中在分生孢子的形态特征和寄主的专一性方面，研究者对种属分类鉴定的依据大多相似，因而给此类微生物的鉴定工作带来了较大的难题[11-12]。随着分子生物学的飞速发展，多基因系统发育分析已成为植物病原菌分类鉴定可信度较高的技术手段。Liu等[13]运用ITS和β-tubulin对Pestalotiopsis sp.真菌进行多基因系统发育分析，并结合形态特征观察，发现分生孢子内着色的细胞颜色是相对稳定的，可作为此类真菌分类的重要依据。李曼等[14]采用形态学鉴定和ITS、tef1多基因测序对植物内生Pestalotiopsis sp.真菌进行系统发育分析，认为分生孢子顶端细胞的附属丝是否呈匙状膨大是对拟盘多毛孢暗色类群进一步分类鉴定的重要特征。Maharachchikumbura等[15-16]选择ACT、β-tubulin、CAL、GAPDH、GS、LSU、RPB1、SSU、ITS和tef1等10个基因对Pestalotiopsis sp.真菌进行分类定种，研究结果表明ITS、β-tubulin和tef1等3个基因的鉴定效果较好;此外，将ITS、β-tubulin和tef1 3个基因序列联合分析能更准确可靠地对Pestalotiopsis sp.真菌进行种属的区分。本研究采用此方法对供试病原菌株进行分子生物学鉴定和多基因系统发育分析，探明其详细分类信息，为病害防控提供理论支撑。

目前，国内外尚未有关于稻曲拟盘多毛孢P.oryzae在滇重楼上危害的研究报道。据此，本研究通过对滇重楼叶斑病病原分子生物学鉴定及生物学特性测定，明确滇重楼叶斑病病原物及其详细分类信息，探索影响病害发生流行的环境因素，以期为该病害的田间诊断和有效防治提供科学依据和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与材料

本研究具典型叶斑病症状的滇重楼标样采自云南省丽江市玉龙纳西族自治县中药材种植基地（100°23′28″E，26°51′43″N）。采用组织分离法分离病原菌，切取3 mm×3 mm大小病健交界处的叶片组织，用10%次氯酸钠溶液浸泡20 s，然后用75%乙醇消毒30 s，最后用无菌水漂洗3次，转至PDA平板培养基中央，25℃黑暗条件下恒温培养至菌落产孢，分离菌株单孢纯化培养，并保存备用。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、查氏（Czapek）培养基、水琼脂（water agar， WA）培养基、燕麦琼脂（OA）培养基、滇重楼汁液（PLA）培养基、滇重楼汁液+PDA（PLA+PDA）培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基、MKB培养基，9种培养基的制备参照陈全助等[17]，穆晓红等[18]的方法进行。

1.2 致病性测定

根据柯赫氏法则，选取滇重楼植株健康叶片，以直径5 mm的菌饼作为接种体，采用无伤接种法，并放置于MGC-450HP人工气候箱内（25～30℃）保湿培养，定期观察并记录植株发病情况。以无菌水处理作空白对照，每处理4次重复。待植株发病后，分离发病植株叶片病斑上的病原物，于Nikon Eclipse E200荧光生物显微镜下观察孢子形态，并与接种菌株孢子形态比较。

1.3 病原鉴定

1.3.1 形态特征观察

无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA培养基上，25℃黑暗条件下恒温培养至菌落形成，观察菌落培养性状;待菌株产孢后，在Nikon Eclipse E200荧光生物显微镜下观察并测量产孢结构和分生孢子的形态及大小。

1.3.2 多基因系统发育分析

采用CTAB法提取纯化菌株总DNA[19]。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增菌株ITS序列[20]，采用T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）扩增菌株β-tubulin （tub2）序列[21]，采用EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）扩增菌株tef1序列[22]。PCR反应采用热启动程序，所用到的10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs均购自大连宝生物科技有限公司。PCR 30 μL反应体系：10 mmol/L 10×PCR Buffer 3.0 μL、2 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、10 mmol/L正向引物和反向引物各1.0 μL、DNA模板1.5 μL，ddH2O 21.0 μL。ITS反應程序：95℃预变性3 min;95℃变性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃ 延伸10 min，4℃条件下保存。β-tubulin反应程序：95℃预变性3 min;94℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环;72℃ 延伸10 min，4℃条件下保存。tef1反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，63℃退火55 s，72℃延伸90 s，10个循环;94℃变性30 s，53℃退火55 s，72℃延伸90 s，36个循环，72℃ 延伸7 min，4℃条件下保存。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果经BLAST 搜索（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）后与 GenBank数据库中相关种属的基因序列进行比较分析，选用同源性较高的模式菌株序列作为参比对象，用Clustal X 1.8软件进行多序列比对，计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性。系统发育分析时排除碱基缺失位点，采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。其中，Bootstrap值设定为1 000，其余均为默认值。

1.4 生物学特性测定

1.4.1 不同培养基对菌株菌丝生长和产孢的影响

无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼分别接种至上述9种供试平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。

1.4.2 温度对菌株菌丝生长和产孢的影响

以PDA培养基为基础培养基，无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA培养基中央，分别放置于5、10、15、20、25、28、30、32、35℃等9个温度梯度恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。

1.4.3 光照对菌株菌丝生长和产孢的影响

以PDA培养基为基础培养基，无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至PDA平板培养基中央，分别放置于25℃ 24 h全暗、12 h光照+12 h黑暗、24 h光照条件下恒温培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。

1.4.4 pH对菌株菌丝生长和产孢的影响

以PDA培养基为基础培养基，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH溶液分别将培养基pH值调为40、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8个不同梯度。无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至不同pH的PDA平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。

1.4.5 碳、氮源对菌株菌丝生长和产孢的影响

以Czapek培养基为基础培养基，分别以相同含量的麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇作为碳源，不添加碳源作无碳空白对照;分别以相同含量的蛋白胨、KNO3、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、NH4Cl作为氮源，不添加氮源作无氮空白对照。无菌条件下，取直径7 mm纯化好的单孢菌饼接种至不同pH值PDA平板培养基中央，并放置于25℃恒温培养箱内黑暗培养5 d，培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，培养15 d后每皿加入10 mL无菌水洗脱孢子，用血球计数板统计各处理的产孢量，每处理设置4个重复。

1.5 数据分析处理

测定数据均采用Duncan氏新复极差法检验不同处理间的差异显著性，数据结果利用DPS 7.05统计软件计算分析，图用Sigma Plot 12.5绘制。

2 结果与分析

2.1 病害症状与致病性测定

将种植基地采集到的滇重楼叶斑病标样进行病原组织分离和单孢培养，获得纯化单孢菌株1株，记作CL107。经致病性测定，纯化单孢菌株CL107能侵染滇重楼并引起叶斑病。滇重楼健康叶片接种纯化菌株并感病后，发病初期老叶叶片上有圆形或不规则的褐色病斑，病斑中心发白，边缘呈暗褐色，有明显轮纹;当培养环境较潮湿时，病斑正面由褐色变为黑褐色，并附着大量的黑色小点，即为叶斑病病原菌的分生孢子堆，背面附着灰色霉层。这与田间滇重楼植株发病症状相一致（图1a、b），并且能从植株接种发病部位再分离到先前的接种菌，以无菌去离子水接种的空白对照植株不表现发病症状（图1c）。根据柯赫氏法则，可将纯化单孢菌株CL107确定为滇重楼叶斑病致病菌。

2.2 病原菌鉴定结果

2.2.1 形态特征观察

单孢菌株CL107于PDA平板培养基25℃黑暗条件恒温培养5 d后，菌落呈近圆形，正面白色，气生菌丝浓密呈絮状;背面淡黄色，具轮纹，菌落直径4.98～5.25 cm（图1d、e）。培养15 d后，菌落表面形成少量黑色黏液即为分生孢子堆，排列不规则，轮纹状较5 d时更明显，无气味（图1f）。菌株CL107成熟分生孢子呈直或略弯的纺锤状，具3～4个隔膜，大小（13.52～28.08）μm×（3.02～7.57）μm，孢子平均大小为23.25 μm×5.47 μm，中間3个细胞着色，上部2个细胞呈深褐色，细胞间隔处颜色较深，第3个细胞呈浅褐色，着色细胞长12.4～15.7 μm;分生孢子梗呈白色圆柱状且较短，长2.7～5.5 μm;分生孢子顶端和尾端的细胞均呈圆锥状，无色透明，顶端细胞有2～3根无色透明附属丝，不分支，长11.3～24.8 μm（图1g、h）。滇重楼接种发病状态下，单孢菌株CL107分生孢子盘附着于叶片背面，呈黑色粒点状，孢子形态大小与纯化菌株培养结果一致（图1i）。根据以上观测特征结果，并参考前人研究结果[23-26]，将单孢菌株CL107初步确定为稻曲拟盘多毛孢P.oryzae。

2.2.2 分子生物学鉴定和系统发育进化树

对分离病原单孢菌株CL107的ITS、tub2和tef1多基因进行扩增测序，获得目的基因片段分别为588、779、266 bp，GenBank登录号分别为MK156295、MN015425、MN022941。经Blast 搜索并与 GenBank数据库中相关种属基因序列比较分析后，菌株CL107与Pestalotiopsis sp.具较高的同源性，挑选亲缘性较高的同属不同种菌株作为参比菌株，用Clustal X 1.8进行多序列比对，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0构建供试菌株与参比菌株之间的系统发育树。结果表明，菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）分别与参比标准菌株P.oryzae CBS 353.69（accession no. NR147547）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199398）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199496）的相似性达100.00%、100.00%、98.92%，菌株间具较高同源性;结合形态特征鉴定结果，可将代表性单孢菌株CL107鉴定为稻曲拟盘多毛孢P.oryzae。

2.3 菌株生物学特性測定

2.3.1 不同培养基对菌株菌丝生长和产孢的影响

不同培养基对菌株CL107菌丝生长和孢子形成具有一定的影响（表1）。供试培养基中，菌株CL107在PDA平板培养基上生长最快，在MKB平板培养基上生长最慢，与其余几种供试培养基相比差异显著（P<0.05）。此外，菌株CL107在不同培养基上的培养性状也有差异，PDA、PSA、OA、PLA和PLA+PDA培养基上菌株气生菌丝较浓密，Czapek、YPD和MKB培养基上则较为稀薄，WA培养基上无气生菌丝产生。菌株CL107在PDA平板培养基上产孢量最高，显著高于其余8种培养基的产孢量（P<0.05），在WA培养基上不产孢，且菌株CL107在OA、PLA+PDA培养基上菌丝生长比PSA培养基上菌丝生长快但产孢量反而低。

2.3.2 温度对菌株菌丝生长和产孢的影响

不同培养温度对菌株CL107菌丝生长和孢子形成具有一定的影响（如图3所示）。当培养温度介于10～32℃之间时，菌株CL107菌丝能正常生长和形成分生孢子;当培养温度大于等于35℃时，菌株CL107停止生长且无分生孢子形成;当培养温度为28℃ 时，菌株生长最快且产孢量最高，产孢量显著高于其余8个温度处理（P<0.05）。

2.3.3 pH对菌株菌丝生长和产孢的影响

不同pH的培养环境对菌株CL107菌丝生长和孢子形成具有一定的影响（图4）。pH介于4.0～11.0之间，菌株CL107均能正常生长且形成分生孢子，当pH=8.0时菌株菌丝生长最快且产孢量最高，其产孢量显著高于其他pH处理（P<0.05）。

2.3.4 光照对菌株菌丝生长和产孢的影响

如表2所示，不同光照条件对菌株CL107菌丝生长和孢子形成影响显著（P<0.05）。全黑暗条件有利于菌株菌落的生长和分生孢子的萌发，光照黑暗交替条件下菌株生长和产孢量显著高于全光照条件。

2.3.5 碳、氮源对菌株菌丝生长和产孢的影响

Czapek培养基添加不同碳、氮源后，能显著促进菌株CL107菌丝生长和孢子萌发，不同碳、氮源对菌株CL107菌丝生长和孢子形成均有影响（图5、图6）。菌株CL107在以葡萄糖为碳源的培养基上菌落生长最快且产孢量最高，产孢量显著高于其余6个不同碳源处理（P<0.05）;在以酵母提取物为氮源的培养基上菌落生长最快，以牛肉膏为氮源的培养基上产孢量最高，且均显著高于其余6个不同氮源处理（P<0.05）。此外，在有机氮源平板培养基上菌株菌丝生长和分生孢子形成均显著高于无机氮源平板培养基。

3 讨论

拟盘多毛孢属Pestalotiopsis sp.是一类重要的植物致病菌，主要分布在全球热带和亚热带地区，在我国大多分布于南方[23-24，26]。据文献报道，Pestalotiopsis sp.的寄主范围十分广泛，可寄生超过50多个科的植物，对闽楠Phoebe bournei [17]、红海榄Rhizophora stylosa [27]、芒果[28]、杨梅[29]、蓝莓[30]、草莓[31]、番石榴[32]等生态作物和经济作物为害比较严重。植物受此类病原物危害后常表现为叶斑、叶枯、腐烂、溃疡等症状，严重影响作物的产量和品质[33-34]。本研究通过形态特征观察和ITS、tub2、tef1多基因系统发育分析，将稻曲拟盘多毛孢Poryzae确定为滇重楼叶斑病病原物，这也是国内外关于稻曲拟盘多毛孢侵染滇重楼并引起叶斑病的首次报道。目前，国内外尚未有关于稻曲拟盘多毛孢生物学特性的研究报道，因而就菌株生长及产孢的最适条件而言，不同的稻曲拟盘多毛孢菌株其生物学特性存在一定的相似性和差异性。这可能是由于稻曲拟盘多毛孢寄主或地域性的差异所决定的，同时也可能与稻曲拟盘多毛孢不同生理型的生物学特性差异有关，还需进一步研究探讨。

滇重楼白霉病主要危害叶片，发病初期叶片上形成近圆形或不规则的水渍状灰褐色病斑，后期逐渐变为黑褐色病斑，且病斑上附着白色霉层;当培养环境较潮湿时，病斑正反面有灰白色霉层，即为病原物的分生孢子堆，且叶片背面较多[4，9]。滇重楼褐斑病也主要侵染叶片，且大多从叶缘或叶尖处开始侵染，发病初期，叶片上有黄绿色水渍状不规则病斑，其后逐渐变为浅褐色，病斑具轮纹，发病严重时病斑连片且叶片边缘枯黄卷缩;当培养环境较潮湿时，病斑上有少量灰绿色小点，即为病原物的分生孢子堆[9]。本研究中，滇重楼受稻曲拟盘多毛孢侵染后，病斑中心发白，具明显轮纹且叶片背面附着灰色霉层，分生孢子堆为黑色，这与以往报道的白霉病和褐斑病有很大的差别。经田间调查及取样分析后可知，由稻曲拟盘多毛孢侵染引起的滇重楼叶斑病发病率在7%～12%之间，发病程度较低，零星发生，主要分布在环境较潮湿的低洼地块，先后在丽江市玉龙纳西族自治县5个不同规模滇重楼种植基地发现此病害。

据单孢菌株CL107的致病性测定和生物学特性测定结果可知，潮湿且中高温环境条件有利于菌丝生长和分生孢子形成，表明高温潮湿是该病害危害的主要环境因素。云南省丽江市玉龙纳西族自治县是滇西北重要的云药之乡，也是我国滇重楼的重要产区之一，种植面积大，产量品质高，经济效益好。玉龙纳西族自治县属于低纬度高原南亚季风气候，夏季气温介于10～26℃之间，湿润多雨，属稻曲拟盘多毛孢适宜生长繁殖的地区，因此滇重楼叶斑病发生流行的潜在风险较高。全黑暗条件有利于菌株CL107菌丝生长和分生孢子的形成，透光性差、种植密度高的苗圃有利于滇重楼叶斑病的发生流行。综上所述，滇重楼种子育苗时，应合理控制好播种密度，保持幼苗透光通风率，必要时适度喷灌控制苗圃内的湿度。此外，滇重楼叶斑病发病时病原物大多从气孔处开始侵染，严重时整个叶片形成深褐色不规则病斑，叶子背面常附着灰色霉层，老叶受害较为严重，而前期新叶的发病率相对较低，后期则新叶发病较为严重，这与室内滇重楼致病性测定结果一致。种植业生产过程中，夏季高温多雨，苗圃内湿度较大，此时滇重楼正处于生长旺盛时期，也是叶斑病的高发期，应合理调控滇重楼的种植密度和苗圃的温湿度，改善植株的透光性和通气度，必要时需科学合理地喷洒杀菌药剂，预防叶斑病的发生流行，保证滇重楼种植产业的稳定绿色发展。

参考文献

[1] 石子为， 康利平， 彭華胜， 等. 我国滇重楼种植的气候适宜性研究[J]. 中国中药杂志， 2017， 42（18）：3435-3442.

[2] 廖秋红， 李艳冰， 刘琴， 等. 滇重楼（Paris polyphylla var.yunnanensis）的内生细菌的分离与鉴定[J]. 分子植物育种， 2018， 16（18）：318-322.

[3] 赵峥， 尹芳园， 耿开友， 等. 生态因子对滇重楼花药开裂的影响[J]. 广西植物， 2016， 36（10）：1192-1197.

[4] 木向春. 玉龙县滇重楼病虫害种类调查及防治[J]. 现代园艺， 2017（18）：65-66.

[5] 杨永红， 严君， 刘君英， 等. 滇重楼根茎腐烂的调查及其主要害虫研究[J]. 中药材， 2009， 32（9）：1342-1346.

[6] 张国辉， 任永权， 李娇梅， 等. 华重楼软腐病的病原鉴定与病害分析[J]. 中国农学通报， 2014，30（7）：306-308.

[7] 马维思， 杨斌， 严世武， 等. 滇重楼茎秆软腐病病原鉴定[J]. 西南农业学报， 2017， 30（7）：1582-1587.

[8] 马青. 滇重楼的病害及其防治[J]. 湖北林业科技， 2009（1）：69-69.

[9] 赵振玲， 张金渝， 陈翠， 等. 滇重楼2种真菌性叶斑病的初步研究[J]. 西南农业学报， 2012， 25（1）：318-321.

[10]马维思， 陈君， 严世武， 等. 滇重楼灰霉病及其病原鉴定[J]. 中国中药杂志， 2018， 43（14）：2918-2927.

[11]韦继光， 徐同， 黄伟华， 等. 从分子系统发育探讨内生拟盘多毛孢与病原拟盘多毛孢的关系[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2005， 24（4）：304-313.

[12]MAHARACHCHIKUMBURA S S N， GUO Liangdong， EKACHAI C， et al. A destructive new disease of Syzygium samarangense in Thailand caused by the new species Pestalotiopsis samarangensis [J]. Tropical Plant Pathology， 2013， 38（3）：227-235.

[13]LIU Airong， CHEN Shuangchen， WU Shangying， et al. Cultural studies coupled with DNA based sequence analyses and its implication on pigmentation as a phylogenetic marker in Pestalotiopsis taxonomy [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2010， 57（2）：528-535.

[14]李曼， 陈唯王， 韦继光， 等. 广西3科植物内生拟盘多毛孢多样性[J]. 生物多样性， 2013， 20（6）：703-709.

[15]MAHARACHCHIKUMBURA S S N， GUO Liangdong， CAI Lei， et al. A multi-locus backbone tree for Pestalotiopsis， with a polyphasic characterization of 14 new species [J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）：95-129.

[16]MAHARACHCHIKUMBURA S S N， HYDE K D， GROENEWALD J Z， et al. Pestalotiopsis revisited [J]. Studies in Mycology， 2014， 79：121-186.

[17]陈全助， 金亚杰， 郭朦朦， 等. 闽楠叶斑病病原鉴定及其生物学特性测定[J]. 植物病理学报， 2018， 48（3）：313-323.

[18]穆晓红， 刘铜华， 孙文， 等. 糖痹康对高糖培养雪旺细胞自噬相关蛋白的影响[J]. 中国实验方剂学杂志， 2018（10）：90-94.

[19]符德欢， 朱高倩， 郭佳玉， 等. 改良CTAB法提取重楼属3种药用植物干燥根茎DNA [J]. 中药材， 2017， 40（6）：1295-1299.

[20]崔晓霞， 束红梅， 蒋璐， 等. 甜叶菊褐斑病的病原菌鉴定及MeJA的抗病作用[J]. 中国农业科學， 2018， 51（18）：91-101.

[21]李雯雯， 赵文霞， 林若竹， 等. 基于ITS和β-tubulin基因分析的居间疫霉菌系统发育[J]. 林业科学， 2018， 54（3）：73-82.

[22]许苗， 叶文武， 王淑琛， 等. 快速检测马铃薯干腐病病原接骨木镰孢的环介导等温扩增技术[J]. 植物病理学报， 2018， 48（1）：55-60.

[23]MAHARACHCHIKUMBURA S S N， GUO Liangdong， CHUKEATIROTE E， et al. Pestalotiopsis—morphology， phylogeny， biochemistry and diversity [J]. Fungal Diversity， 2011， 50（1）：167-187.

[24]CROUS P W， SUMMERELL B A， SWART L， et al. Fungal pathogens of Proteaceae [J]. Persoonia Molecular Phylogeny & Evolution of Fungi， 2011， 27（1）：20-45.

[25]MAHARACHCHIKUMBURA S S N， CHUKEATIROTE E， GUO Liangdong， et al. Pestalotiopsis species associated with Camellia sinensis （tea） [J]. Mycotaxon， 2013， 123（1）：47-61.

[26]柳凤， 杨顺锦， 詹儒林， 等. 澳洲坚果叶斑病病原鉴定及其生物学特性[J]. 植物保护学报， 2011， 38（5）：437-442.

[27]张小媛， 何红， 胡汉桥，等. 红海榄赤斑病病原菌鉴定及其生物学特性研究[J]. 植物病理学报， 2009， 39（6）：584-592.

[28]ISMAIL A M， CIRVILLERI G， POLIZZI G. Characterisation and pathogenicity of Pestalotiopsis uvicola and Pestalotiopsis clavispora causing grey leaf spot of mango （Mangifera indica L.） in Italy [J]. European Journal of Plant Pathology， 2013， 135（4）：619-625.

[29]REN Haiying， LI Gang， QI Xingjiang， et al. Identification and characterization of Pestalotiopsis spp. causing twig blight disease of bayberry （Myrica rubra Sieb. & Zucc） in China [J]. European Journal of Plant Pathology， 2013， 137（3）：451-461.

[30]赵洪海， 岳清华， 梁晨. 蓝莓拟盘多毛孢枝枯病的病原菌[J]. 菌物学报， 2014， 33（3）：577-583.

[31]赵景楠， 马喆， 刘正坪， 等.草莓拟盘多毛孢叶斑病的病原菌[J]. 菌物学报， 2016， 35（1）：114-120.

[32]KEITH L M， VELASQUEZ M E， ZEE F T. Identification and characterization of Pestalotiopsis spp. causing scab disease of guava， Psidium guajava， in Hawaii [J]. Plant Disease， 2006， 90（1）：16-23.

[33]韦继光， 徐同， 潘秀湖， 等. 拟盘多毛孢属的分类学研究进展[J]. 基因组学与应用生物学， 2006， 25（1）：78-85.

[34]韦继光， 徐同， 黄伟华， 等. 从分子系统发育探讨内生拟盘多毛孢与病原拟盘多毛孢的关系[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2008， 34（4）：367-373.

（责任编辑：田 喆）