我国河南和甘肃地区梨树根癌病病原菌鉴定

杨雯 张志想 李世访

摘要 近年来，我国梨树根癌病多有发生，危害严重，但病原尚不明确。本研究采集了河南商丘和甘肃庆阳梨树根瘤，共分离得到13个分离物，对其进行形态特征观察、序列分析和特异性PCR检测、生理生化测定和致病性测定。结果表明，这13个分离物在NA平板上的菌落呈白色、圆形，单菌落中间凸起、边缘整齐。它们均能在New Kerr培养基上良好生长。其16S rRNA基因序列與GenBank中已登录的Agrobacterium tumefaciens和A.rhizogenes序列相似性大于98%。将分离物人工接种向日葵后能使接种部位产生癌瘤。鉴定结果表明，梨树根瘤中分离出的13个分离物均为生物Ⅱ型土壤杆菌。

关键词 根癌病; 梨树; 病原菌

中图分类号： S 436.612

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019420

Abstract In recent years， pear crown gall occurred frequently and caused serious damage in China， but the pathogen of this disease is still unclear. Thus， we collected the root nodules of pear from Shangqiu in Henan province and Qingyang in Gansu province to identify the pathogen of pear crown gall in these areas. Total of 13 isolates were obtained and then morphological observation， sequence analysis and specific PCR detection， physiological and biochemical assay and pathogenicity determination were performed. The colonies of these 13 isolates on the NA plate were white， round and middle convex， and had neat edges. All the isolates grew well on New Kerr medium. Their 16S rRNA sequences had high similarity （>98%） with those of Agrobacterium tumefaciens and A.rhizogenes registered in GenBank. Bioassays on sunflower seedlings indicated that all these isolates infected sunflower seedlings and stimulated gall formation at the inoculation site. In a word， these 13 isolates from the root nodules of pear tree were all Agrobacterium type Ⅱ.

Key words crown gall; pear; pathogen

根癌病又称根瘤病、冠瘿病，是由根癌土壤杆菌属Agrobacterium spp. 的致病菌引起的根部细菌性病害。该属病原菌可侵染多种果树如桃、苹果、梨、樱桃、葡萄等[1]，使植物的根及根颈部位形成大小不等的癌瘤。癌瘤初期幼嫩，呈乳白色或略带红色，柔软光滑;后期木质化而变得坚硬，呈褐色，表面粗糙或凹凸不平，严重时整个主根变成一个大癌瘤[2-3]。果树患病后，侧根减少，水分养分运输受阻，叶薄色黄。发病晚期，由于病株的根部对水分和养料吸收差，树势衰弱，落花落果，严重时整株干枯死亡[1]。

根据生理、生化及致病性特征，根癌土壤杆菌属可分为3种生物型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[4-6]。桃树根癌病病原菌主要是生物Ⅰ型和Ⅱ型[7-8];樱桃根癌病病菌大部分属于生物Ⅱ型，少部分为生物Ⅰ型[9];对山东苹果根癌病致病菌进行系统检测发现，大部分为生物Ⅱ型，少数为生物Ⅰ型[10]。葡萄根癌病病原菌生理生化上有别于Ⅰ型和Ⅱ型，被单独列为生物Ⅲ型。我国葡萄根癌病病原菌主要为Ⅲ型[11]。

近年来，我国梨树根癌病多有发生，危害严重。然而我国梨树根癌病病原菌及其生物型尚无报道。本研究调查和采集河南商丘、甘肃庆阳梨树根瘤，对病原菌进行检测和鉴定，明确两个地区根癌病的病原菌及其生物型，为根癌病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年3月-4月，采集8份梨树根瘤，其中2份来自河南商丘，6份来自甘肃庆阳。

1.2 培养基及主要试剂

D1M选择性培养基：NH4Cl 1.0 g，纤维二糖50 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaH2PO4·H2O 1.0 g，孔雀绿0.01 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为 7.0～7.2。

NA培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，牛肉浸膏3.0 g，酵母浸粉1.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为7.0。

NB培养液：不含琼脂，其他同NA培养基。

PDA培养基：马铃薯提取物 200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为7.0。

New Kerr培养基：赤鲜醇5.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 0.1 g，NaCl 0.2 g，CaCl2 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeEDTA 2.0 mL，生物素2.0 μg，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为7.0，放线菌酮250 μg/mL，亚硒酸钠100 μg/mL。

2% NaCl LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉3 g，NaCl 20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为7.0。

3-酮培养基：乳糖10 g，酵母浸膏1 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH为7.0。

PCR及电泳相关试剂和仪器：2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司;1.1×T3 Super PCR Mix，擎科生物技术公司;BIO-RAD MyCycle仪，Bio-Rad公司;DYY-6C电泳仪，北京六一生物科技有限公司;KCBIO-2008凝胶成像系统，北京原平皓生物技术有限公司。

1.3 病原菌的分离和纯化

用清水将根瘤冲洗干净，自然风干后用75%乙醇擦拭表面消毒。剥去表层死亡组织，用无菌刀片从不同方位切取内部幼嫩白色或粉红色的组织2～3块，并切成2 mm×2 mm大小。将其放入75%乙醇中浸泡15 s，然后用无菌水冲洗2次，放入2 mL离心管中。加入1.5 mL无菌水，用灭菌玻璃棒捣碎。浸泡15～30 min后，取100 μL浸泡液涂布于D1M选择性培养基。28℃培养2～4 d，挑取单菌落于NA平板上划线纯化。

1.4 病原菌分子生物学鉴定

1.4.1 16S rRNA 基因序列分析

挑取单菌落于装有NB培养液的1.5 mL离心管中，28℃，180 r/min培养18～24 h，利用细菌16S rRNA 基因通用引物27F/1492R[12]进行菌液PCR扩增。25 μL的反应体系中包括：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物27F和1492R各1 μL，ddH2O 9 μL，菌液1.5 μL。反应程序为：95℃预变性5 min;94℃变性1 min，54℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸10 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳、回收纯化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。在NCBI上利用BLAST与GenBank中已注册的序列进行相似性比对。

1.4.2 T-DNA区和Vir区特异性分子鉴定

利用根癌土壤桿菌质粒上T-DNA区和Vir区特异性引物对菌液的特定序列进行PCR检测。T-DNA区引物为Tip6F/Tip6R[13]，Vir区引物为VirD2A/VirD2C[14]。PCR反应体系为15 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 13.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板DNA 0.6 μL。反应程序为：98℃预变性3 min;98℃变性10 s，56℃退火 10 s，72℃延伸 10 s，共35个循环;72℃延伸 2 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 病原菌生理生化鉴定

形态学鉴定：依据根癌菌的不同生物型在New Kerr培养基和PDA培养基上生长形态的不同，初步鉴定生物类型。在New Kerr培养基上，只有生物Ⅱ型能生长良好[15];PDA培养基上，生物Ⅰ型生长良好、黏液多，生物Ⅱ型生长差、甚至不长，生物Ⅲ型生长好、不产生黏液[16]。

3-酮测定[17]：将菌株在3-酮培养基上点接，涂抹成约1 cm直径的小斑点，28℃培养3～4 d。培养好的平板上倒一薄层Benedict试剂，室温静置，观察是否产生黄色晕圈。生物Ⅰ型能产生明显黄色晕圈，而生物Ⅱ型、生物Ⅲ型不变色。

35℃生长试验[16]：利用接种环蘸取菌液点接在NA平板上，35℃培养2～3 d，观察菌株生长情况。生物Ⅰ型能在35℃条件下生长良好，而生物Ⅱ型、生物Ⅲ型生长差甚至不生长。

2% NaCl LB培养试验[16]：利用接种环蘸取菌悬液点接于2% NaCl LB平板上，28℃培养2～3 d，观察菌株生长情况。生物Ⅰ型、生物Ⅲ型能在2% NaCl LB培养基上生长良好，而生物Ⅱ型对2% NaCl不耐受。

1.6 致病性测定

利用向日葵作为指示植物，测定分离菌株的致病性。用无菌水冲洗平板上培养的菌株，将其浓度调至109 cfu/mL（OD600=1）。在约10 cm高的向日葵幼苗的茎部，用无菌刀片划10条约0.5 cm长的伤口，将其用蘸取菌液的无菌脱脂棉包裹住，外面再用封口膜包住。48 h后去除包裹，14 d后观察癌瘤产生情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离

从梨树根瘤中共分离菌株13个，其中9个来自河南商丘，4个来自甘肃庆阳。在NA平板上，这13个菌株的菌落均呈白色、圆形，单菌落中间凸起，边缘整齐，正反面颜色一致（图1）。

2.2 16S rRNA基因序列分析

利用16S rRNA基因通用引物27F/1492R，对分离得到的13株菌进行扩增，可以得到1.5 kb左右的片段。测序（表1）及序列分析结果表明，分离自河南商丘梨树的9株菌与A.rhizogenes（NR_113607）的序列相似性最高，大于98%;分离自甘肃庆阳梨树的4株菌与A.tumefaciens（NR_041396）的序列相似性最高，也大于98%。由此可知，这13株菌属于土壤杆菌属。

2.3 T-DNA区和Vir区分子鉴定

利用根癌土壤杆菌的T-DNA区和Vir区特异性引物对分离的13个菌株进行PCR扩增，发现这13株菌均能扩增出特异性条带，大小分别为243 bp（引物Tip6F/Tip6R）（图2a）和224 bp（引物VirD2A/VirD2C）（图2b）。同时具有T-DNA区和Vir区的土壤杆菌属细菌能够导致果树根瘤的产生，试验结果进一步表明，获得的13株菌为能引发根癌病的土壤杆菌属细菌。

2.4 生理生化鉴定

对分离的13株菌进行3-酮试验、2% NaCl LB培养、35℃生长试验以及在New Kerr和PDA培养基上进行选择性培养等生理生化测定。结果表明，与左侧生物Ⅰ型对照相比，这13株菌在含3-酮的培养基上不产生黄色晕圈（图3a）;对2% NaCl不耐受，因为在2% NaCl LB培养基中难以生长（图3b）;35℃条件下，在NA培养基上难以生长（图3c）。此外，这13株菌均能在New Kerr培养基上生长（图3d）。这些结果符合生物Ⅱ型土壤杆菌的生理生化特征。由此可知，这13株菌应该均为生物Ⅱ型根癌土壤杆菌。

2.5 致病性测定

将分离的13株菌分别接种指示植物向日葵。从图4可知，接种14 d后，接种的向日葵的茎部均产生了明显的癌瘤，大小约为5 mm×5 mm，病情指数均约为83。取癌瘤组织再次进行分离鉴定，结果表明，可以从中分离出土壤杆菌。这表明，所获得的13株菌均具有致病性。

3 讨论

近年来，梨树根癌病在一些产区时有发生，对生产造成了显著的影响[18]。病原鉴定是病害防控的前提，但目前国内外对梨树根癌病检测报道较少，我国梨树根癌病的病原尚未有系统的分离鉴定。为此，我们采集了河南商丘和甘肃庆阳共8份梨树根瘤进行分离鉴定，确定梨树根癌病病原菌。

本试验从梨树根瘤中共分离出13株细菌，通过形态学鉴定和分子鉴定确定为根癌土壤杆菌，接种指示植物向日葵均能够引发癌瘤。通过3-酮、2%NaCl等生理生化试验鉴定13株病原菌均为生物Ⅱ型。Kerr等[19]对希腊不同城市梨树根癌病病原菌进行分离鉴定，分离出的5株病原菌均属于生物Ⅱ型的放射根癌土壤杆菌，与本文结果一致，且鉴定出5株生物Ⅱ型病原菌对土壤杆菌素84敏感。

对于果树根癌病的防治，主要包括选育抗病品种、物理切除、化学药剂防治、生物防治4个方面。目前，最有效的方式为利用生防菌剂K84进行根癌病的生物防治，并且已经在桃、樱桃等果树根癌病防控中取得较好成效[20]。K84防治根癌病主要通过生态位竞争及产生土壤杆菌素84杀死病原菌[2]，Kerr等试验证明梨树根癌病病原菌对土壤杆菌素84敏感[19]，因此，可利用K84对我国梨树根瘤分离出的菌株进行敏感性测试，进一步验证K84是否对我国梨树根癌病具有防控作用。

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（責任编辑：杨明丽）