知母及其不同炮制品的指纹图谱建立与抗氧化活性的谱效关系研究

贾毓欣 刘海帆 司明东 李新蕊 宋军娜 郑玉光 马东来

摘 要 目的：建立知母及其不同炮制品乙醇提取物和丙酮提取物的指紋图谱，并考察其与抗氧化活性的谱-效关系。方法：分别采用高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD），色谱条件分别为色谱柱Thermo BDS Hypersil C18、流动相乙腈-0.2%醋酸水溶液、流速1.0 mL/min、柱温30 ℃、检测波长258 nm、进样量10 μL以及色谱柱XDB-C18、流动相乙腈-0.2%醋酸水溶液（梯度洗脱）、流速0.9 mL/min、柱温30 ℃、雾化器温度40 ℃、氮气流速1.6 mL/min、进样量10 μL。分别以芒果苷、知母皂苷BⅡ为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》绘制20批知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物的指纹图谱并进行相似度评价，标定共有峰。以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率为指标，考察20批知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物的抗氧化活性。以DPPH自由基清除率为因变量、共有峰峰面积为自变量，采用偏最小二乘回归法分别分析知母乙醇提取物和丙酮提取物与抗氧化活性的谱-效关系。结果：从20批知母炮制品乙醇提取物指纹图谱中标定出共有峰8个（M1～M8），指认出芒果苷（色谱峰M7）;相似度为0.389～1.000;从丙酮提取物指纹图谱中标定出共有峰7个（S1～S7），指认出知母皂苷BⅡ（色谱峰S5）;相似度为0.044～0.999。20批知母及其炮制品乙醇提取物的DPPH自由基清除率为21.23%～81.39%，生知母显著低于盐知母、酒知母（P<0.001）;丙酮提取物的DPPH自由基清除率为49.73%～83.78%，生知母显著高于盐知母、酒知母、炒知母（P<0.001）。知母乙醇提取物图谱中峰M2～M7的标准化回归系数均大于0，与抗氧化活性成正相关;仅峰M7的变量重要性投影（VIP）值大于1。知母丙酮提取物图谱中峰S4～S7的标准化回归系数均大于0，与抗氧化活性成正相关;VIP值大小排序依次为峰S5>S6>S4，且VIP值均大于1。结论：成功建立知母乙醇提取物和丙酮提取物的指纹图谱。芒果苷（峰M7）可能是知母乙醇提取物抗氧化作用的主要药效物质;知母皂苷BⅡ（峰S5）、峰S6、峰S4可能是知母丙酮提取物抗氧化作用的主要药效物质。

关键词 知母;乙醇提取物;丙酮提取物;抗氧化活性;谱-效关系;偏最小二乘回归法

中图分类号 R282;R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）22-2706-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.04

ABSTRACT   OBJECTIVE： To establish the fingerprint of ethanol extract and acetone extract from Anemarrhena asphodeloides and its different processed products， and to investigate the spectrum-effect relationship between the fingerprint and the antioxidant activity. METHODS： HPLC method and HPLC-ELSD method were adopted. The determination was performed on Thermo BDS Hypersil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% acetic acid at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was set at 258 nm. The sample size was 10 μL. The determination was performed on XDB-C18 columnwith mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% acetic acid（gradient elution）at the flow rate of 0.9 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The temperature of atomizer was 40 ℃ and the flow rare of N2 was 1.6 mL/min. The sample size was 10 μL. Using mangiferin and timosaponin BⅡ as reference， Fingerprint Similarity Eva- luation System of TCM Chromatogram （2004A edition） was adopted to draw the fingerprint of ethanol extract and acetone extract from 20 batches of A. asphodeloidesand its different processed products to confirm common peaks. Using scavenging rate of 1， 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） radical as index， antioxidant activities of ethanol extract and acetone extract from 20 batches of A. asphodeloides and its processed products were investigated. Using scavenging rate of DPPH radical as dependent variable， common peak area as independent variable， PLSR was used to analyze the spectrum-effect relationship of ethanol extract and acetone extract from A. asphodeloides with antioxidantion activity. RESULTS： Eight peaks （M1-M8） were identified in the fingerprints of ethanol extracts from 20 batches of processed A. asphodeloides. Mangiferin （chromatogram peak M7） was identified with similarity of 0.389-1.000; seven comon peaks （S1-S7） and timosaponin BⅡ （peak S5） were identified in the fingerprint of acetone extract， and the similarity was 0.044-0.999. DPPH radical scavenging rate of ethanol extract from 20 batches of A. asphodeloides and its processed products was 21.23%- 81.39%， and A. asphodeloides was significantly lower than salt-processed A. asphodeloides with salt wine-processed A. asphodeloides （P<0.001）; and that of acetone extract was 49.73%-83.78%， and A. asphodeloides was significantly higher than stir-baked A. asphodeloides with salt， wine or fire （P<0.001）. The standardized regression coefficients of peaks M2-M7 in the spectrum of ethanol extract from A. asphodeloides were all greater than 0， which was positively correlated with antioxidant activity. Only the variable importance projection （VIP） value of peak M7 was greater than 1， which had an important contribution. The standardized regression coefficients of peaks S4-S7 in the acetone extract spectrum of A. asphodeloides were greater than 0， and were positively correlated with antioxidant activity. The order of VIP values was peak S5>S6>S4， and the VIP values were all greater than 1. CONCLUSIONS： The fingerprint of the different processed products A. asphodeloides and its antioxidant activity spectral effect relationship were successfully established;mangiferin （peak M7） may be the main antioxidant substance of ethanol extract from A. asphodeloides. Timosaponin BⅡ （peak S5）， peak S6 and peak S4 may be the main antioxidant substance in acetone extract from A. asphodeloides.

KEYWORDS   Anemarrhena asphodeloides; Ethanol extract; Acetone extract; Antioxidant acitivity; Spectrum-effect relationship; Partial least squares regression

知母为百合科植物知母Anemarrhena asphode-    loides Bge.的干燥根茎，具有清热泻火、生津润燥之功效;现代药理研究表明，知母具有抗炎、抗血小板聚集、抗肿瘤等作用[1]。知母始载于《神农本草经》[2]，药用历史悠久，主产于我国河北、山西、山东、陕西等地，其主要化学成分有黄酮类、甾体皂苷类、木质素类和有机酸类等[3-5]。临床常用的炮制品有盐知母、酒知母和炒知母等，不同炮制品间化学成分含量或药效活性各有差异，这主要与不同炮制方法所致化学成分变化各不相同有关[6-7]。但目前有关知母炮制品的研究多集中在化学成分分析或药理活性等单一研究上[8-9]，鲜有将化学成分与药理活性相结合以探讨知母及其炮制品药效物质基础的谱-效关系的研究。

中药作为一个复杂整体，仅通过指纹图谱或单一药效活性评价其质量优劣是不全面的[10-11]。中药谱效关系是将中药指纹图谱中的多组分变化与其药效活性相关联，对中药进行综合评价，以避免单一指标评价的片面性。因此，本文基于前期研究成果[12]，以知母乙醇提取物和丙酮提取物为对象，建立知母不同厂家、不同炮制品的指纹图谱;在抗氧化活性研究基础上，利用偏最小二乘回归法（PLSR）分析指纹图谱共有峰与抗氧化活性的谱-效关系，以期为进一步阐明知母抗氧化活性的药效物质基础提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent-1260型高效液相色谱仪，含紫外检测器和蒸发光散射检测器（ELSD）（美国Agilent公司）;UV-2600型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）;ME204E型电子天平（德国Sartorius公司）;KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;Milli-Q型超纯水仪（美国Milipore公司）。

1.2 药品与试剂

芒果苷对照品（批号：P04M9F60454，纯度：≥98.0%）、知母皂苷BⅡ对照品（批号：R14D9F77658，纯度：≥98.0%）均购自上海源叶生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma公司，批号：STBD2362V，纯度：>98.0%）;乙腈和醋酸等均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

炒知母饮片、酒知母饮片、盐知母饮片和生知母饮片均经河北中医学院中药鉴定与炮制教研室郑玉光教授鉴定为百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎，饮片标本保存于河北中医学院药材标本室。样品来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 知母乙醇提取物HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 知母乙醇提取物供试品溶液的制备 参考2020年版《中国药典》（一部）方法[1]，精密称取知母或其炮制品饮片粉末（过60目筛，下同）0.1 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声（功率：400 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷至室温，再次称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，混匀，过0.45 μm滤膜，即得知母乙醇提取物供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇定容于50 mL量瓶中，制成质量浓度为50.2 μg/mL的对照品溶液。

2.1.3 色谱条件与系统适用性考察 色谱柱：Thermo BDS Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.2%冰醋酸水溶液（15 ∶ 85，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱温：25 ℃;检测波长：258 nm;进样量：10 μL。取芒果苷对照品溶液、知母乙醇提取物供试品溶液（编号：Z4）和阴性对照溶液（70%乙醇），按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，芒果苷色谱峰与相邻色谱峰间的分离度均大于1.50，拖尾因子介于0.95～1.05之间;按芒果苷峰计理论板数均大于6 000，且阴性对照无干扰，详见图1。

2.1.4 精密度试验 取同一批次的知母乙醇提取物供试品溶液（编号：Z4）适量，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果，以芒果苷峰为参照，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.23%和1.03%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一批次的知母乙醇提取物供试品溶液（编号：Z4）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以芒果苷峰为参照，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.19%和1.94%（n=6），表明知母乙醇提取物供试品溶液在室温下放置24 h的稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批次样品（编号：Z4）粉末1.0 g，共6份，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备乙醇提取物供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以芒果苷峰为参照，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.20%和2.27%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.7 知母乙醇提取物的指纹图谱研究 取20批知母及其炮制品适量，按“2.1.1”项下方法制备乙醇提取物供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将所得色谱图导入《中藥色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》中，以Z1图谱为参照图谱，设置时间窗口为0.1 min，对指纹图谱中的共有峰进行多点校正，匹配生成20批知母及其炮制品乙醇提取物的叠加指纹图谱;并采用平均数法生成对照指纹图谱（R1），详见图2。从20批知母及其炮制品乙醇提取物的HPLC指纹图谱中标定出共有峰8个（M1～M8）;与芒果苷对照品的HPLC分析结果（见图1A）对比，指认峰M7为芒果苷。

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》对20批知母及其炮制品乙醇提取物的指纹图谱进行相似度评价。结果，20批知母及其炮制品乙醇提取物的相似度为0.389～1.000，说明知母及其不同炮制品乙醇提取物的化学成分存在明显差异，详见表2。

2.2 知母丙酮提取物的HPLC-ELSD指纹图谱研究

2.2.1 知母丙酮提取物供试品溶液 参考2020年版《中国药典》（一部）方法[1]，称取知母及其炮制品饮片粉末（过60目筛，下同）0.15 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入30%丙酮100 mL，称定质量，超声（功率：400 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷至室温，再次称定质量，用30%丙酮补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得丙酮提取物供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 取知母皂苷BⅡ对照品适量，精密称定，用30%丙酮定容于50 mL量瓶中，得质量浓度为0.49 mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 色谱条件与系统适用性考察 色谱柱：XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%A;5～15 min，5%A→35%A;15～20 min，35%A→100%A;20～25 min，100%A）;柱温：30 ℃;流速：0.9 mL/min;雾化器温度：40 ℃;氮气流速：1.6 mL/min;进样量为：10 μL。取知母皂苷BⅡ对照品溶液、知母丙酮提取物供试品溶液（编号：Z4）和阴性对照溶液（30%丙酮），按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，知母皂苷BⅡ的色谱峰与相邻色谱峰间的分离度均大于1.50，拖尾因子介于0.95～1.05之间;按知母皂苷BⅡ峰计理论板数均大于10 000，且阴性对照无干扰，详见图3。

2.2.4 精密度试验 取同一批次的知母丙酮提取物供试品溶液（编号：Z4）适量，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。结果，以知母皂苷BⅡ峰为参照，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.17%和0.89%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一批次的知母丙酮提取物供试品溶液（编号：Z4）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以知母皂苷BⅡ峰为参照，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.22%和1.65%（n=6），表明知母丙酮提取物供试品溶液在室温下放置24 h的稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批次的样品（编号：Z4）粉末1.0 g，共6份，精密称定，按“2.2.1”项下方法制备丙酮提取物供试品溶液，再按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以知母皂苷BⅡ峰为参照，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.32%和2.07%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.7 知母丙酮提取物的指纹图谱研究 取20批知母及其炮制品适量，按“2.2.1”项下方法制备丙酮提取物供试品溶液，再按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度評价系统（2004A版）》中，按“2.1.8”项下方法生成知母炮制品丙酮提取物的叠加指纹图谱和对照指纹谱图（R2），详见图4。从20批知母及其炮制品丙酮提取物的指纹图谱中标定出共有峰7个（S1～S7），与知母皂苷BⅡ对照品的HPLC分析结果（见图3A）比对，指认峰S5为知母皂苷BⅡ。

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》对20批知母及其炮制品丙酮提取物的指纹图谱进行相似度评价。结果，20批知母及其炮制品丙酮提取物的相似度为0.044～0.999，说明知母及其不同炮制品丙酮提取物的化学成分存在明显差异，详见表3。

2.3 DPPH自由基抗氧化活性的测定

在预试验基础上，本研究将知母乙醇提取物和知母丙酮提取物的浓度分别设定为3.8、2.1 g/mL（以提取物质量计）。参考刘爱朋等[13]报道方法，分别精密量取知母乙醇提取物和丙酮提取物溶液2 mL，精密加入0.16 mmol/L DPPH乙醇溶液1 mL，混匀，静置30 min，以5 000 r/min离心5 min，取上清液，用紫外-可见分光光度计在517 nm波长处测定吸光度（A1）。另用水2 mL替换样品溶液，与DPPH乙醇溶液混合后，同法测定吸光度（A0）。用水1 mL替换DPPH乙醇溶液，与样品溶液混合后，同法测定吸光度（A2）。上述试验均平行操作3次，取平均值，并按下列公式计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=（A1-A2）/A0×100%，结果见表4。

2.4 谱-效关系分析

参考文献方法[14]，利用SIMCA 14.1软件，以20批知母及其炮制品乙醇提取物或丙酮提取物的DPPH清除率为因变量，共有峰的峰面积为自变量，采用PLSR法分析，计算标准化回归系数和变量重要性投影（VIP）值，评价知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物与抗氧化活性的谱-效关系。

2.4.1 乙醇提取物的谱-效关系 知母及其炮制品乙醇提取物图谱中，峰M2～M7的标准化回归系数均大于0，提示其与抗氧化活性成正相关[15];仅色谱峰M7（芒果苷）的VIP值大于1，提示其对抗氧化活性具有重要贡献[16]，详见图5。

2.4.2 丙酮提取物的谱-效关系 知母及其炮制品丙酮提取物图谱中，峰S4～S7的标准化回归系数均大于0，提示其与抗氧化活性成正相关[15];VIP值排序为色谱峰S5（知母皂苷BⅡ）>S6>S4，且VIP值均大于1，提示其对抗氧化活性具有重要贡献[16]，详见图6。

3 讨论

知母中富含多种药效成分，本文以2020年版《中国药典》（一部）规定的知母乙醇提取物和丙酮提取物为对象，建立了其指纹图谱，并对其相似度进行了评价。结果显示，20批知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物指纹图谱中分别标定出共有峰8、7个，相似度分别为0.389～1.000、0.044～0.999，表明知母及其炮制品中化学成分有显著差异，因此在临床应区别使用。

本文以DPPH自由基的清除率为抗氧化活性的药效学指标，分析了知母及其不同炮制品乙醇提取物和丙酮提取物的抗氧化活性。结果显示，知母不同炮制品的乙醇提取物和丙酮提取物的抗氧化能力存在显著差异，盐知母乙醇提取物的抗氧化能力最强，而生知母丙酮提取物的抗氧化能力最强。

为了进一步揭示知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物成分与抗氧化活性之间的内在联系，本文采用PLSR法分析了20批知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物的指纹图谱共有峰峰面积与抗氧化活性的谱-效关系。结果显示，知母乙醇提取物中仅芒果苷（M7）的标准化回归系数大于0且VIP值大于1，提示芒果苷可能是知母乙醇提取物抗氧化作用的主要药效物质;丙酮提取物中知母皂苷BⅡ（峰5）、峰6、峰4的标准化回归系数大于0且VIP值大于1，提示其可能是知母丙酮提取物抗氧化作用的主要药效物质，其中知母皂苷BⅡ的抗氧化活性最显著。

综上所述，本研究成功建立了知母及其炮制品乙醇提取物和丙酮提取物的指纹图谱，初步证实了芒果苷和知母皂苷BⅡ是知母及其炮制品抗氧化活性的药效重要物质基础。但本文在研究指纹图谱与抗氧化活性的谱-效关系时，只考察了共有峰与DPPH自由基清除活性的关联，并未考察非共有峰，这为今后的研究提供了思路，同时还有待于对未知成分进行鉴定和含量分析。

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（收稿日期：2020-07-13 修回日期：2020-10-20）

（编辑：邹丽娟）