植物同源域指2在卵巢癌中的表达及对癌细胞转移的影响

王 佳，杨 蕾，刘 菲

根据统计数据表明，2019年卵巢癌的新发病率占女性肿瘤的3%，其病死率排名第5[1]。尽管近几十年来生活水平和卵巢癌治疗技术在不断提高，但是卵巢癌患者的总生存率并未显著改善[2]。导致卵巢癌患者预后不良的主要因素之一是转移率较高，而目前卵巢癌转移的分子机制尚未明确[3]。植物同源域指2(plant homeodomain finger 2, PHF2)是一种二甲基化的组蛋白H3赖氨酸9(H3K9me2)脱甲基酶，在肝细胞的糖异生、体外巨噬细胞免疫及同源性的信号传递和脂肪形成中发挥重要作用[4]。相关研究报道，PHF2在急性淋巴细胞白血病和肾透明细胞癌等多种肿瘤中低表达，并与肿瘤的临床病理参数相关[5-6]，但是PHF2在卵巢癌中的表达及作用未知。在肝细胞肝癌中PHF2的较低表达会促进肿瘤细胞迁移，并与患者的整体生存期较差相关[7]。目前PHF2与卵巢癌的转移是否存在相关性引起研究人员的关注。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与肿瘤发生、发展密切相关，肿瘤细胞通过EMT获得周围侵袭和远处转移的能力，是肿瘤侵袭转移的重要作用机制[8]。因此本文通过研究PHF2在卵巢癌中的表达意义，以及在卵巢癌细胞转移中的作用和对EMT的影响，旨在获得PHF2作为治疗卵巢癌新靶点的重要实验室依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2015年1月—2019年12月入住我院首次行手术治疗的原发性卵巢癌患者，收集术前未经放化疗、免疫治疗等任何形式抗肿瘤治疗的卵巢癌组织标本80例，其中患者年龄32～70(48.78±15.64)岁；>50岁者42例，≤50岁者38例；浆液性癌49例，黏液腺癌31例；分化程度：中高分化64例，低分化16例；国际妇产科联合会(FIGO)分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期21例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；有脉管侵犯45例，无脉管侵犯35例；淋巴结转移37例，无淋巴结转移43例。另纳入同时期因良性疾病手术获得的正常卵巢组织30例，患者年龄41～73(49.98±13.04)岁，与肿瘤患者临床资料具有可比性。所有患者均签署知情同意书，本研究由医院医学伦理委员会审核通过。

1.2实验试剂 载玻片和非免疫羊血清购自中国福州迈新生物技术开发有限公司；二甲苯和乙醇购自中国深圳中粤化学有限公司；枸橼酸钠抗原修复液和加拿大中性树胶购自中国北京Solarbio试剂公司；DAB试剂盒购自丹麦DAKO试剂公司；PHF2、上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)抗体购自美国proteintech公司；卵巢癌细胞系CP70、CoC1和CAOV-4及人正常卵巢上皮细胞系IOSE80购自美国ATCC细胞库；细胞培养基、FBS和胰酶购自美国Gibco公司；强效蛋白裂解液和BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo公司；PVDF膜购自美国Bio-Rad公司；ECL化学发光试剂盒购自中国大连Meilunbio®公司；PHF2过表达质粒购自湖南丰晖生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Coring公司。

1.3免疫组织化学检测 卵巢癌组织和正常卵巢组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，及梯度浓度乙醇水化，枸橼酸钠抗原修复液(0.01 mol/L，pH值6.0)中高压煮沸3 min，3%过氧化氢甲醇溶液中避光室温孵育30 min，滴加非免疫羊血清室温封闭1 h。滴加PHF2一抗(稀释比为1∶100)，PBS代替PHF2一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜。PBS洗涤5 min，3次。滴加DAB试剂盒中的二抗，37℃孵育30 min，PBS洗涤5 min，3次。DAB显色(阳性为黄色)，苏木素染核，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，干燥，封片。在低倍显微镜下观察染色强度和染色面积，并评分。染色强度：无黄色为0分，浅棕黄色为1分，黄色为2分，深黄色为3分；染色面积<5%为0分，5%～25%为1分；26%～50%为2分；51～75%为3分；≥76%为4分。染色强度和染色面积二者之和>3分为阳性表达，≤3分为阴性表达。

1.4细胞培养 卵巢癌细胞系CP70、CoC1和CAOV-4及人正常卵巢上皮细胞系IOSE80快速复苏后重悬于含有10% FBS的培养基中，放置培养瓶中，在37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞培养基颜色变化时，更换新鲜培养基。细胞长满时，PBS洗涤1次，胰酶消化培养基重悬后传至2个培养瓶中进行细胞传代。

1.5western blotting检测蛋白的表达 CP70、CoC1、CAOV-4和IOSE80细胞长满时，胰酶消化收集细胞，2000 r/min离心5 min，获得细胞斑块。强效蛋白裂解液将细胞斑块溶解后放置冰上完全裂解，14 000 r/min低温离心后获得蛋白上清液。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，蛋白裂解液加入上样缓冲液后煮沸变性。蛋白上样后进行凝胶电泳，湿转后将含有蛋白的PVDF膜放入封闭液中孵育1 h，TBST洗3次，PVDF膜放入一抗稀释液中4℃孵育过夜。TBST洗3次，PVDF膜放入二抗稀释液中室温孵育2 h，ECL曝光条带，采用ImageJ软件检测蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.6PHF2过表达质粒的转染 选择PHF2表达低的卵巢癌细胞系进行过表达质粒的转染。细胞长满时，胰酶消化收集细胞计数。以每孔1.5×105个细胞铺至6孔板中，分为对照组和实验组，铺板12 h后采用lip2000进行质粒转染，对照质粒和lip2000混匀后转染至对照组细胞，PHF2过表达质粒和lip2000混匀后转染至实验组细胞，转染6 h后更换新鲜培养基，采用western blotting检测各组质粒的转染效果。

1.7Transwell实验 取转染48 h的对照组和实验组细胞，胰酶消化后采用无血清培养基洗3次后计数，以1.0×105个细胞加入PBS润湿的Transwell小室微孔膜上，将Transwell小室放置37℃、5% CO2培养箱中培养。12 h后取出Transwell小室，PBS洗3次后，将小室放入甲醇溶液中固定15 min，吉姆萨染色15 min后，将微孔膜取出放置载玻片上封片。显微镜下拍照后计数各组细胞穿膜的数目。

2 结果

2.1数据库分析PHF2在卵巢癌组织的表达 采用癌症基因组数据库(the cancer genome atlas, TCGA)分析PHF2在卵巢癌组织的表达水平，结果显示426例卵巢癌组织中PHF2 mRNA的表达水平低于88例正常对照组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 TCGA数据库分析PHF2在卵巢癌组织的表达情况

2.2PHF2在卵巢癌组织的表达 PHF2在卵巢癌组织的阳性表达率明显低于正常卵巢组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 卵巢癌和正常卵巢组织PHF2表达情况[例(%)]

2.3卵巢癌患者PHF2表达与临床病理参数的关系 卵巢癌患者PHF2阳性表达与淋巴结转移和FIGO分期相关(P<0.05)，而与年龄、组织类型、分化程度和有无脉管侵犯均无关(P>0.05)。见表2。

表2 卵巢癌患者PHF2表达与临床病理参数的关系[例(%)]

2.4PHF2蛋白在卵巢癌细胞中的表达情况 PHF2蛋白在卵巢癌细胞CP70、CoC1和CAOV-4中的表达分别为0.97±0.12、0.29±0.07和1.71±0.23，在人正常卵巢上皮细胞系IOSE80中的表达为2.98±0.31。PHF2蛋白在卵巢癌细胞CP70、CoC1和CAOV-4中的表达明显低于正常卵巢上皮细胞系IOSE80(P<0.01)，其中在CoC1细胞中的表达最低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。故应用CoC1细胞转染PHF2过表达质粒。

图2 PHF2蛋白在卵巢癌细胞和人正常卵巢上皮细胞中表达水平

2.5PHF2过表达质粒的转染效果 PHF2蛋白在实验组CoC1细胞中的表达为1.31±0.18，对照组CoC1细胞中的表达为0.37±0.10。PHF2蛋白在实验组CoC1细胞中的表达显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3。上述结果表明PHF2过表达质粒成功转染CoC1细胞，可进行后续实验。

图3 2组卵巢癌CoC1细胞PHF2蛋白表达的情况

2.6PHF2对卵巢癌细胞转移的影响 对照组的穿膜细胞数为201.67±15.85，实验组穿膜细胞数为113.33±10.54。与对照组比较，实验组细胞转移能力明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 PHF2过表达对卵巢癌CoC1细胞转移能力的影响(吉姆萨染色 ×100)

2.7PHF2对卵巢癌细胞EMT的影响 PHF2过表达质粒转染卵巢癌细胞CoC1后，在对照组和实验组中E-cadherin蛋白的表达分别为0.41±0.16和1.08±0.07，N-cadherin蛋白的表达分别为0.37±0.09和0.11±0.03，vimentin蛋白的表达分别为1.22±0.30和0.29±0.08。与对照组比较，实验组E-cadherin蛋白表达明显增加，N-cadherin和vimentin蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图5。

图5 PHF2过表达对卵巢癌CoC1细胞EMT的影响

3 讨论

卵巢癌是一种严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤。在中国，2016年报告了5万多例新发卵巢癌病例和2万多例卵巢癌死亡病例[9]。目前卵巢癌的临床治疗策略非常有限，主要包括手术、化学疗法和靶向治疗药物，对卵巢癌患者尤其是晚期患者的治疗效果不佳[10-12]。由于卵巢癌早期症状不明显，并且具有高侵袭性和转移性，大部分患者确诊时已是晚期，导致其5年生存率仅有30%左右[2]。腹膜内侵入和转移是卵巢癌恶性表现的重要特征[3]。近年来，许多研究都集中在卵巢癌的分子靶向治疗上，其中抗血管生成药、多腺苷二磷酸核糖聚合酶和叶酸受体靶向药物等治疗卵巢癌取得了一定的疗效，但目前多处于临床试验阶段，因此迫切需要开发新的潜在卵巢癌靶向药物[13-14]。

PHF2是KDM7组蛋白脱甲基酶家族的成员，位于9q2染色体上，该家族在Jumonji-C和N端结构域中包含植物同源结构域。PHF2通过使H3K9me2脱甲基化，诱导与脂肪生成相关的基因转录，在脂肪形成的表观遗传调控中发挥作用[4]。肿瘤的发生、发展过程中也存在表观遗传调控[15]，已经在多种肿瘤类型中发现了PHF2的异常表达，PHF2的表达在急性淋巴细胞白血病患者中显著降低，而其低表达与白血病细胞增殖以及B细胞急性淋巴细胞白血病的不良预后标志物升高相关[5]。有研究发现，在254例肾透明细胞癌中，PHF2高表达150例，低表达104例，但是PHF2的高表达与较低的Fuhrman核级、较小的肿瘤大小、较低的总分期和较长的肿瘤特异性生存率以及无进展生存期相关，而其低表达促进肾透明细胞癌的恶性进展[6]。但是，PHF2在卵巢癌中的表达水平未知，TCGA是包含卵巢癌在内的31种恶性肿瘤的基因组公开数据库，利用TCGA数据库可以分析肿瘤组织和对照组织中差异表达的基因。本文研究结果发现，PHF2 mRNA在卵巢癌组织中的表达水平低于正常对照组织，PHF2在卵巢组织中的表达明显下调，并且PHF2阳性表达与卵巢癌患者的淋巴结转移和FIGO分期显著相关。表明PHF2在卵巢癌中可能发挥抑癌基因的作用，与PHF2在其他肿瘤中的报道一致。

有研究报道，PHF2作为miR-221的靶基因影响肝细胞癌的细胞迁移能力，即PHF2低表达会促进肝细胞癌肿瘤细胞迁移，PHF2在肝细胞癌组织中低表达与患者预后较差相关[7]。但PHF2与卵巢癌细胞的迁移能力是否相关未知，因此首先检测了PHF2在卵巢癌细胞系和人正常卵巢上皮细胞系中的表达水平，结果显示PHF2在卵巢癌细胞系中的表达显著低于人正常卵巢上皮细胞系，与在卵巢癌组织表达水平一致。选择PHF2低表达的卵巢癌细胞系进行PHF2过表达质粒转染，Transwell实验检测发现，PHF2过表达能够抑制卵巢癌细胞的转移能力，但其作用机制仍需进一步研究。上皮细胞能在特定的生理、病理条件下失去极性、黏附能力下降及细胞拉长，表现出间质细胞表型。生理性的EMT在胚胎发育、组织再生等正常生理活动中发挥重要作用，病理性的EMT与肿瘤转移密切相关，是包括卵巢癌在内的恶性肿瘤发生转移的重要机制[8,16-17]。EMT发生的早期E-cadherin表达降低，导致基底膜降解、细胞骨架改变、细胞活动性增强，是EMT的重要诱发因素，E-cadherin蛋白在卵巢癌中低表达[18]。N-cadherin的高表达促使EMT的发生，可作为EMT的标志物，N-cadherin在卵巢癌中高表达，且与卵巢癌组织分化差相关[19]。细胞骨架蛋白中另外一个重要成员vimentin是EMT的重要因子，vimentin高表达增加细胞与周围细胞分离，使细胞与间质充分接触，促使细胞发生迁移，vimentin在卵巢癌中高表达[20]。本研究结果发现，PHF2能够抑制卵巢癌细胞中N-cadherin和vimentin蛋白的表达，促进E-cadherin蛋白的表达，表明PHF2能够抑制卵巢癌EMT的发生。

综上所述，PHF2在卵巢癌细胞和组织中低表达，与卵巢癌患者的淋巴结转移和FIGO分期相关，PHF2可能通过抑制EMT的发生降低卵巢癌细胞的转移能力。PHF2可作为卵巢癌治疗的潜在靶点。