nm23-H1和HBME-1在乳头状甲状腺癌中的表达及其临床意义

周 静，何志伟，简善军，顾 菁，阙 挺

甲状腺癌是临床上最为常见的头颈部恶性肿瘤，发病年龄相对较低，多发生于40～60岁之间，且表现有明显的性别差异，女性群体约占所有患者总数的75%[1]。甲状腺癌的来源与类型多种多样，根据病理分型，又可分为乳头状癌、滤泡状癌及髓样癌，其中乳头状癌最为常见，占总患者群体的80%以上，且近年来的发生率持续攀升[2-4]。乳头状甲状腺癌往往分化较好，有着良好的预后，外科手术是乳头状甲状腺癌治疗的首选方式。据研究统计，局限性的乳头状腺癌首次实施腺叶切除后对侧腺叶的复发率约为7%[5]。nm23-H1是20世纪研究人员在小鼠的黑色素瘤细胞中发现的一组基因，可以通过介入GDP与GTP之间的转化调控微管蛋白，进而影响肿瘤细胞的增殖和黏附性，在多种肿瘤疾病如肺癌、乳腺癌等中的作用均得到了深入的研究[6-7]。HBME-1作为一种间质上皮细胞抗体被认为在甲状腺肿瘤中具有重要的诊断价值，可以与间质上皮细胞表面的糖蛋白特异性结合，作用于肿瘤细胞的血管生成、细胞周期与迁移[8]。本研究通过回归性分析的方式，对就诊于我院的甲状腺癌患者术后病理标本进行nm23-H1和HBME-1水平的相关检测，以探究2种指标在乳头状甲状腺癌诊断和预后中的应用价值。

1 资料与试剂

1.1一般资料 选取2010年1月—2018年1月就诊于我院，并行外科手术治疗的乳头状甲状腺癌患者90例，术后病理均明确诊断。其中男34例，女56例；肿瘤直径1 cm以上48例；年龄(48.67±5.42)岁，50岁以上38例，50岁以下52例；伴有颈部淋巴结转移患者10例，未伴有颈部淋巴结转移患者80例；临床分期Ⅰ期27例，Ⅱ期38例，Ⅲ期和Ⅳ期25例。①纳入标准：术中活检结果提示乳头状甲状腺癌诊断明确；一般临床资料齐全，患者病理样本储备良好；存档有术后2年以上的复查记录；术前未接受放射治疗、化学治疗等。②排除标准：合并有其他原发肿瘤患者；合并尿毒症、严重心肺功能不全等其他重症患者；术后其他因素导致的死亡患者；

1.2实验试剂 nm23-H1与HBME-1的一抗、二抗均购自丹麦Dako公司。蛋白提取试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司，BCA定量试剂盒、Trizol裂解液、ECL发光试剂盒、PCR扩增、逆转录相关试剂盒均购自德国Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1Western Blot法处理癌组织和癌旁组织：对所有乳头状甲状腺癌患者的癌组织和癌旁组织进行nm23-H1与HBME-1蛋白的测定。量取100 mg组织样本，反复使用裂解液和蛋白酶抑制剂冲洗裂解6次，每次持续5 s，静置片刻后，4℃条件下离心处理，转速设置为12 000 r/min，离心15 min后收集上清液。使用BCA试剂盒，将组织上清液浓度定量为5 μg/μl，上样电泳，电压设置为70 V，时长90 min，随后转膜。加入脱脂奶粉封闭，加入一抗在保温箱处理过夜，TBST洗膜。加入二抗处理，其中nm23-H1二抗稀释比例1∶2000，HBME-1稀释比例1∶4000。室温轻摇孵育90 min，最后ECL化学发光法显影。

1.3.2RT-PCR法处理癌组织和癌旁组织：对所有乳头状甲状腺癌患者的癌组织和癌旁组织进行nm23-H1与HBME-1的mRNA测定。量取100 mg组织样本，匀浆机研磨后加入Trizol裂解液，从样品中分离总RNA。使用SuperScript Ⅲ反转录酶将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增。nm23-H1上游引物：5'-CCAGACGGACCTCGGCAGTCG-3'，下游引物：5'-CACCGGCAGCAGGCTGCAG-3'；HBME-1上游引物：5'-GAATGTGAGCATGGACTTGG-3'，下游引物：5'-ACGTGGGGTCCCAGAAGT-3'；扩增反应在LC480热循环仪上一式双份进行。nm23-H1与HBME-1的基因表达使用相对定量模型进行效率校正，对个体的组织表达进行单独定量，将个体样品的相对表达值设置为100%。

2 结果

2.1癌组织与癌旁组织中nm23-H1和HBME-1的蛋白与mRNA表达水平 癌组织中nm23-H1和HBME-1的蛋白与mRNA表达水平均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1和图1。

表1 乳头状甲状腺癌患者癌组织与癌旁组织中nm23-H1和HBME-1蛋白与mRNA表达水平比较

图1 乳头状甲状腺癌患者癌组织与癌旁组织中nm23-H1和HBME-1的蛋白与mRNA定量分析

2.2癌组织nm23-H1表达与病理特征的关系 癌组织的nm23-H1蛋白和mRNA表达水平与乳头状甲状腺癌患者的肿瘤直径、颈部淋巴结转移、临床分期有相关性，其中肿瘤直径>1 cm、伴有颈部淋巴结转移、临床Ⅲ和Ⅳ期患者的nm23-H1蛋白和mRNA表达水平更高，差异有统计学意义(P<0.05)。而癌组织的nm23-H1蛋白和mRNA表达水平与乳头状甲状腺癌患者的年龄、性别无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 乳头状甲状腺癌患者癌组织nm23-H1表达与病理特征的关系

2.3癌组织HBME-1的表达与病理特征的关系 癌组织的HBME-1蛋白和mRNA表达水平与乳头状甲状腺癌患者的肿瘤直径、颈部淋巴结转移、临床分期有相关性，其中肿瘤直径>1 cm、伴有颈部淋巴结转移、临床Ⅲ和Ⅳ期患者的HBME-1蛋白和mRNA表达水平更高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。而癌组织HBME-1蛋白和mRNA表达水平与乳头状甲状腺癌患者的年龄、性别无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 乳头状甲状腺癌患者癌组织HBME-1的表达与病理特征的关系

2.4乳头状甲状腺癌术后复发患者癌组织nm23-H1和HBME-1表达比较 本次研究中2年内复发患者8例，复发率为8.89%。复发患者的nm23-H1和HBME-1蛋白与mRNA表达水平均显著高于未复发患者，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 复发与非复发乳头状甲状腺癌患者癌组织nm23-H1和HBME-1表达比较

3 讨论

尽管乳头状甲状腺癌在临床上发生的频率较高，约占所有恶性肿瘤的1/30，但是由于分化程度高，所以相较于其他肿瘤，具有预后良好的突出特点，外科治疗后的复发率也较低。本次研究中选取的90例乳头状甲状腺癌患者中2年内共有8例出现复发，复发率为8.89%，该结果与相关研究较为接近[5]。另一方面，由于乳头状甲状腺癌病灶小且隐匿，而且患者往往无任何明显的临床表现，一般很难在早期及时发现，常常是出现了淋巴结转移才被确诊。由于在临床上缺乏灵敏的分子标记物协助诊断以及术后对患者复发可能性进行评估。为此，本研究通过回归性分析的方式，使用更为精确的Western Blot和RT-PCR方法，对乳头状甲状腺癌患者术后的病理标本进行nm23-H1和HBME-1表达水平的相关检测，以探究其在乳头状甲状腺癌诊断和预后评估中的应用价值。

本研究结果显示，在癌组织中nm23-H1的蛋白与mRNA表达水平均高于癌旁组织，提示在癌细胞中nm23-H1存在着突出表达。且这种突出表达可能与疾病的发生、发展存在着某种因果联系。病理特征相关性研究中，肿瘤直径>1 cm、伴有颈部淋巴结转移、临床Ⅲ和Ⅳ期患者癌组织中nm23-H1蛋白与mRNA表达水平也更高，验证了nm23-H1与肿瘤恶化程度的正相关性。Zhang等[9]通过免疫组织化学、Western Blot和 RT-PCR等方法监测nm23-H1在小鼠和人类中的动态表达，使用siRNA屏蔽了nm23-H1基因的表达后，人类和小鼠胚胎干细胞的增殖与分化都出现了明显降低，证实了nm23-H1在细胞增殖分化中存在促进作用，并提出该作用是通过PI3K-Akt-mTOR途径实现的。在肺癌的相关研究中发现，nm23-H1也被证明能够促进恶性病灶的持续进展[10]。在本研究复发患者与非复发患者的比较中发现，复发患者nm23-H1的蛋白与mRNA表达水平均显著高于未复发患者。提示nm23-H1的蛋白与mRNA表达水平高的患者复发率也可能越高。

关于HBME-1在甲状腺癌诊断中的应用，早在21世纪初就有研究人员使用免疫组织化学染色得出阳性总体准确率为77.2%的结论，提出HBME-1免疫组织化学染色在临床上可能有助于筛查滤泡状癌高复发风险的病例，并且良性腺瘤病例需要密切随访[11]。本研究结果显示，在癌组织中HBME-1的蛋白与mRNA表达水平均显著高于癌旁组织，提示在乳头状甲状腺癌细胞中HBME-1存在着突出表达。另外，肿瘤直径>1 cm、伴有颈部淋巴结转移、临床Ⅲ和Ⅳ期患者癌组织中HBME-1表达水平更高，而且复发患者HBME-1的蛋白与mRNA表达水平均显著高于未复发患者。提示HBME-1水平的高表达同样预示着乳头状甲状腺癌的高复发风险。

综上所述，nm23-H1和HBME-1的表达水平与乳头状甲状腺癌的临床病理特征具有相关性，肿瘤直径大、分期高、伴颈部淋巴结转移患者的nm23-H1和HBME-1表达水平更高，其高表达提示不良预后。故nm23-H1和HBME-1检测对于临床上乳头状甲状腺癌的诊断和预后评估具有一定的参考价值。