捕获和连接的环介导等温扩增技术

骈红茹，杨明珠，郑 直

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 中心实验室， 北京 100005)

随着生物医学的发展，建立高灵敏度、高特异性且快速简便的核酸检测方法在疾病的早期诊断、病原体的检测和筛查及防治等方面有着重要的作用[1]。这一需求在今年新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的诊断、筛查和防治方面更加凸显[2]。核酸扩增技术具有操作简便、灵敏度高等优点。因而，在核酸检测中有广泛的应用[3]。这些方法大多需要提取核酸，人工提取费时费力；使用仪器提取可有所改进，但是仪器价格昂贵且成本较高[4]。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR, RT-PCR)是最常用的方法[5]。但是该方法具有一定的局限性，热循环步骤使其对仪器精密度要求较高，且操作时间较长。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术可在等温条件下进行，具有快速、高效和灵敏度高等特点[6-7]。本研究拟建立一种探针捕获和连接的环介导等温扩增(capture and ligation-based-LAMP, CLIP-LAMP)技术，无需核酸提取，无需反转录，等温条件下进行扩增，流程简单快速，旨在为核酸检测提供新的高效、灵敏的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品：包括来自健康受试者的血液样本、来自云南盈江县的干血斑样品和来自北京协和医学院基础医学研究所的血液培养的恶性疟原虫样品。所有样品均获得北京协和医学院伦理委员会批准(批准文号:032-2016)及受试者知情同意。

1.1.2 主要试剂：蛋白酶K和血液DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；裂解液、96孔捕获板和洗液(Diacutate公司)；T4 多聚核苷酸激酶和Bst DNA 聚合酶大片段(New England Biolabs，NEB公司)；T4 DNA 连接酶(北京康为世纪生物科技有限公司)；dNTPs(宝日医生物技术(北京)有限公司)；甜菜碱(Sigma-Aldrich公司)；SYBR Green I(厦门致善生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1 样品的采集：干血斑样品按照WHO规定的标准采集流程进行指尖血采样、记录及过夜晾干。实验时使用打孔钳获取直径为5 mm的血片，置于样品管中。为了防止交叉污染，样品间将打孔钳在空白滤纸上打5个空白孔。血液样本使用真空采样管抽取一定量的静脉血。血液培养的恶性疟原虫样品由北京协和医学院基础医学研究所王恒教授馈赠。

1.2.2 捕获探针和检测探针的设计：选取4种疟原虫(卵圆型疟原虫L48987、间日疟原虫U03079、恶性疟原虫M19172、三日疟原虫AF488000)的 18S rRNA的共同的保守序列，以此序列为模板，使用Quantigene Designer软件进行捕获和检测区域的选择。结合LAMP设计的原则，设计具有茎环结构的检测探针。探针和引物由Invitrogen公司合成。

1.2.3 标准品的准备：取红细胞培养的恶性疟原虫样品按1∶5的比例加入裂解体系中进行裂解。裂解体系包括裂解液、蛋白酶K。用微滴式数字PCR技术对裂解样品中的疟原虫的18S rRNA基因拷贝数浓度进行定量，以对疟原虫浓度进行精确定量，测得裂解液的疟原虫浓度为1.56×105p(parasite)/μL。将将此裂解样品作为标准品进行后续实验。

表1 CLIP-LAMP探针和引物序列Table 1 Sequence of probes and primers for CLIP-LAMP

1.2.4 CLIP-LAMP实验方法：CLIP-LAMP的实验过程大致可以分为裂解、捕获、连接和LAMP扩增4个部分(图1)。裂解体系60 μL，包括有20 μL的3×裂解液，3 μL 20 g/L的蛋白酶K，0.6 μL的100 nmol/L探针工作液以及10 μL全血或1个5 mm血片；置于恒温振荡仪中56 ℃，30 min进行裂解反应。 取50 μL的裂解产物于捕获板中，置于PCR仪中55 ℃，2 h进行捕获反应。将板内液体去除，并使用1×洗液以150 μL /孔清洗管壁3次，拍干。加入50 μL的连接体系，包括有2 μL的5×106U/L的T4 DNA连接酶，10 μL的5×连接缓冲溶液，置于PCR仪中，37 ℃，20 min进行连接反应。将板中液体去除，加入25 μL的LAMP反应体系，包括有甜菜碱，上游引物FIP，下游引物BIP，dNTP，Bst DNA聚合酶大片段，SYBR Green Ⅰ，1×ThermoPol 反应缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4和 0.1% Triton X-100，pH 8.8)；置于实时荧光定量PCR仪中，65 ℃，40 min进行扩增反应，每一分钟采集1次荧光信号。

图1 捕获和连接的环介导等温扩增技术的 实验原理示意图Fig 1 Principle of capture and ligation-based loop- mediated isothermal amplification

1.2.5 标准q-PCR：参考文献[8]订购q-PCR定量检测疟原虫的18S rRNA基因的Taqman探针和引物。取直径为5 mm的血片用试剂盒提取DNA。q-PCR体系25 μL，包括有12.5 μL的2× Taq Probe Premix，400 nmol/L的引物，200 nmol/L的 探针及1 μL DNA；置于实时荧光定量PCR仪中，95 ℃ 30 s热变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环进行扩增反应。

2 结果

2.1 CLIP-LAMP检测疟原虫的特异性分析

CLIP-LAMP检测疟原虫感染的血液样本(positive control)具有扩增信号(图2)，无模板对照者(NTC)并无扩增信号，健康人血样本对照(negtive control)亦无扩增信号。提示本方法具有良好的特异性，可准确检测到疟原虫感染样本中的18S rRNA。

图2 CLIP-LAMP检测疟原虫的特异性评估Fig 2 Detection specificity of CLIP-LAMP

2.2 CLIP-LAMP检测疟原虫的灵敏度分析

实时荧光曲线上荧光阈值对应的反应时间即Ct值与疟原虫的浓度的对数值在9.6 p/μL到0.01 p/μL的浓度范围内呈现良好的线性关系，线性方程为Ct=24.01-3.27 lgC，相关系数R=0.996。低至0.01 p/μL的疟原虫可以被定量检测出来(图3)。

2.3 CLIP-LAMP检测疟原虫的重复性分析

各个浓度的Ct值变异系数(cofficient of variaiton，CV)均小于5%(表2)。

2.4 CLIP-LAMP在临床样本中的应用

6个干血斑样品中4份疟原虫18S rRNA阳性(表3)，此结果与国际通用的标准q-PCR[8]验证结果一致。

3 讨论

本研究建立了一种探针捕获和连接反应的环介导等温扩增技术，通过捕获板和特殊设计的探针可特异性地从样品中捕获靶标核酸，继而在原板进行环介导等温扩增。无需进行常规的核酸提取，省时省力且避免核酸的损失；当靶标为RNA时无需进行反转录过程。在一个温度下实现扩增反应，相较于传统PCR反应，无需对仪器温度调节精密要求的热循环过程。

图3 CLIP-LAMP检测疟原虫的实时荧光曲线和线性关系Fig 3 Detection sensitivity and dynamic range of CLIP-LAMP

表2 CLIP-LAMP的重复性分析Table 2 Reproducibility of n=3)

表3 CLIP-LAMP和标准q-PCR两种方法对样品的检测结果比较

本方法可以针对靶标序列设计多对探针，实现多区域的覆盖，并同时进行扩增。通常病毒具有很高的变异，这一特点尤其在病毒的检测中具有很大的优势，可有效降低假阴性的出现。多对的检测探针具有通用的茎环结构[9]，可在LAMP扩增中使用通用的引物，保证LAMP反应较高的扩增效率，且可通用于其他靶标的检测中。

疟疾是一种在全世界多个国家流行和具有广泛分布的传染病[10]。本研究将CLIP-LAMP方法运用到疟原虫的检测。该方法可准确和特异性地检测到疟原虫的18S rRNA，同时标准q-PCR也验证了本方法的检测结果的准确性。该方法较传统的镜检和RDT具有较高的灵敏度，适用于大规模的疟疾筛查。

综上所述，本研究建立了一种捕获和连接的环介导等温扩增技术，为医学诊断和病原体检测提供新的具有较高的灵敏度和特异性的方法。