自噬在CaSR介导的非小细胞肺癌细胞系A549迁移中的作用

刘佳龙，李春临，李光伟

(齐齐哈尔医学院 基础医学院 病理生理学教研室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

肺癌(lung canser)在全国恶性肿瘤发病中列首位，是影响人类健康的重要杀手，非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma，NSCLC) 是其最常见的类型[1]，多数病例在诊断时已处于晚期，导致其5年生存率低，且肺癌患者发病率处逐年上升趋势[2]，但其具体机制不详。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)是广泛存在于细胞膜上一种G蛋白偶联受体, 其在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[3]，但在肺癌中关于CaSR与自噬及转移的关系鲜有报道。恶性肿瘤生长的微环境中存在低氧，且低氧可以活化多种细胞的CaSR。通过前期对临床肺癌组织标本探究发现，肺腺癌和鳞癌的组织中均有CaSR蛋白的表达，CaSR可上调肿瘤细胞的增殖、侵袭过程[4]，同时CaSR的表达与细胞自噬具有一定相关性，自噬在CaSR介导的细胞转移中是否起作用，目前尚不十分清楚。为探究其具体机制，本课题以非小细胞肺癌细胞系A549为研究对象，进行以下研究，以期为临床肺癌治疗研发潜在引导方案、开创新的药物靶向作用点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：人非小细胞肺癌细胞系(non-small-cell carcinoma cell line)A549(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.1.2 主要试剂：氯化钆 (gadlinium chloride,GdCl3)、NPS2390、CaSR鼠源单克隆抗体、重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)鼠源单克隆抗体、HRP标记的兔抗鼠二抗(Santa Cluz公司)；3-甲基腺嘌呤自噬抑制剂(3-methyladenine,3-MA)(Sigma-Aldrich公司)；胎牛血清血清(杭州四季青生物科技有限公司)；BCA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Transwell小室 (Corning 公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将细胞分为：对照组(control，N)；低氧组(H)：三气培养箱(93% N2、2% O2、5% CO2)培养24 h；GdCl3(CaSR激动剂，Gd)干预组(H+Gd)：加入GdCl3(30 μmol/L)；NPS2390(CaSR抑制剂,NPS)干预组(H+NPS): 加入NPS2390(10 μmol/L)；3-MA干预组(H+Gd+3-MA)：加入3-MA(30 μmol/L)和GdCl3(30 μmol/L)，均置于三气培养箱内培养 24 h。

1.2.2 Western blot检测Beclin-1 和CaSR表达水平：刮取细胞分别加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育30 min，超声波裂解细胞，4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min，取上清进行蛋白定量。取30 μg样品，10% SDS-PAGE，300 mA转膜90 min，封闭2 h；Ⅰ抗分别为anti-CaSR (1∶500)，anti-β-actin(1∶500)，anti-Beclin-1 (1∶500) 4 ℃过夜。洗膜后，碱性磷酸酶标记IgG 二抗室温孵育2 h，发光，扫描半定量分析显影条带。

1.2.3 Wound healing实验检测细胞迁移：取2块6孔板, 用marker笔在板的背面水平划线, 每隔0.5 cm标记1次, 横穿孔径, 每孔至少5条线穿过。每孔加入约5×105个A549细胞, 以过夜能铺满整孔为标准, 细胞贴壁后去血清培养24 h。次日用200 μL移液器头垂直于背侧线进行划痕。PBS洗涤3次, 去除移液器头划下细胞, 1号板置于正常培养箱内,2号板置于三气培养箱内, 分别培养24 h。进行取样拍照[3]。应用Image J软件分析分别检测各组细胞0 和24 h的细胞划痕面积, 伤口愈合百分比=(0 h的划痕面积-24 h的划痕面积)/0 h的划痕面积×100%。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞侵袭能力：按基质胶∶DMEM=1∶29比例稀释基质胶后铺入上室。分别离心各组细胞，用去血清培养基重悬，调整细胞悬液至1.0×105个/mL接种于上室，加去血清培养基，按照分组情况分别于上室内加药，将含有10%胎牛血清的完全培养基800 μL加入下室，置于常氧及三气培养箱内培养24 h；取出上室, 用棉签擦拭去未转移细胞, PBS洗涤2次，甲醇固定上室细胞20 min，PBS洗涤，适当风干，0.5%的结晶紫进行细胞染色20 min, PBS洗涤, 风干。倒置显微镜下随机抽取5个不同视野, 拍照并计数细胞[5]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同组CaSR表达水平

低氧组CaSR的表达较对照组显著增加(P<0.05)，激动剂组CaSR表达进一步增加(P<0.05)，抑制剂组CaSR表达有所下降(P<0.05)(图1)。

2.2 不同处理对Beclin-1 表达水平产生影响

低氧组较对照组比较Beclin-1 的表达量显著降低(P<0.05)，低氧基础上CaSR激动剂使Beclin-1 表达进一步下降(P<0.05)，CaSR抑制剂组使Beclin-1表达升高(P<0.05)，3-MA组使Beclin-1 表达降低(P<0.05)(图2)。

2.3 不同处理对细胞迁移的影响

低氧组细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于对照组(P<0.05)，H+Gd细胞划痕间伤口愈合距离百分比进一步上升(P<0.05)，H+NPS细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显下降(P<0.05)，3-MA组细胞划痕间伤口愈合距离百分比进一步提高(P<0.05)(图3)。

2.4 不同处理条件对细胞趋化、侵袭的影响

低氧组细胞穿膜数量高于对照组(P<0.05)：CaSR激动剂组细胞穿膜数量上升(P<0.05)，抑制剂组穿膜数量下降(P<0.05)，与H+Gd组比较3-MA自噬通路抑制剂组穿膜数量有所增高(P<0.05)(图4)。

3 讨论

近年来肺癌发病率不断升高,目前治疗手段仍以手术治疗、放化疗、靶向治疗为主，其五年生存率为4%～17%[6]，晚期肺癌患者常常失去了手术机会。肺癌治疗研究相关报道较多，《美国临床肿瘤学会临床实践指南更新》提出由单方面因素对症治疗逐渐形成综合系统性治疗方案[7]。但晚期治疗方式依旧处于基础阶段，肺癌的发生机制仍不明确。

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group图1 Western blot 检测CaSR蛋白表达水平Fig 1 Protein expression relative level of CaSR determined by Western

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group图2 Western blot检测Beclin-1 蛋白表达水平Fig 2 Protein expression relative level of Beclin-1 determined by Western

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group图3 细胞划痕实验检测A549细胞划痕伤口愈合Fig 3 Wound closure was observed by wound healing in A549 cells (scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H+Gd group;△P<0.05 compared with H group图4 Transwell小室法检测各组细胞穿膜数量Fig 4 Number of invaded under different conditions by Transwell (scale bar=50 μm)

CaSR是一种人体广泛表达的同型二聚体G蛋白偶联受体，其功能除维持Ca2+和其他金属离子的稳态及调节甲状旁腺激素的释放外，与细胞的分化、迁移，大脑发育、干细胞移植、伤口愈合以及肿瘤的生长和转移有相关性，CaSR在侵袭转移性肿瘤中的高表达被认为是预测肿瘤转移的一种新的潜在预后标志物[8]。

低氧是实体肿瘤普遍存在的微环境。低氧可以活化多种细胞的CaSR，在海马神经元、神经母细胞瘤、人气道上皮细胞及血管平滑肌细胞中均存在CaSR且在低氧状态下表达量升高[4,9-11]。非小细胞肺癌是肺癌的常见类型，前期通过对临床肺癌组织标本的调研发现：在非小细胞肺癌组织中存在CaSR的表达，其表达强度与肿瘤TNM分期呈正相关趋势，提示CaSR的表达可能与非小细胞肺癌的转移侵袭有关[12]。本研究结果亦显示低氧能够增加A549细胞CaSR的表达。

以自噬为研究对象提出创新的治疗策略，能够改善包括癌在内的不同疾病的治疗方案[13]。本研究结果显示，自噬效应蛋白(Beclin-1)的表达变化与CaSR的表达趋势恰恰相反，而自噬通路抑制剂组Beclin-1表达明显降低。因此，推测A549细胞中的CaSR可能通过抑制自噬的发生，引起细胞其他的生物学行为发生改变。

细胞转移与侵袭相关指标检测结果进一步提示：低氧活化的CaSR在某种程度上抑制了细胞自噬的发生，进而促进A549细胞的转移侵袭过程，通过多机制间相互作用达到协同目标。细胞转移侵袭现象随着细胞内CaSR的表达程度而同步变化，3-MA抑制剂阻断了细胞自噬发生，细胞的侵袭转移指标也相应上调。文献报道，CaSR介导的整合素激活能够促进细胞迁移活动[8,10]，与本实验结果一致。本研究表明：低氧条件下活化的CaSR抑制了A549细胞自噬的发生在某种程度上促进了细胞迁移、侵袭过程。

综上所述，低氧活化的CaSR介导细胞自噬过程促进了A549的转移与侵袭，但更多详细机制仍有待阐明，本研究为非小细胞肺癌的临床治疗方向提供了新思路与新靶点。