人尿液细胞来源的诱导多能干细胞定向分化为毛囊干细胞

周化腾，李长明，王利祥，胡劲涛，杜伟斌，章何陋，任伟凡

(浙江中医药大学附属江南医院 骨科，浙江 杭州 311201)

利用组织工程技术修复大面积皮肤缺损一直是医学领域研究的热点，毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSCs)被认为是构建组织工程皮肤较为理想的种子细胞，不仅能促进创面上皮化，还参与形成毛囊和汗腺等皮肤附件[1]，在皮肤修复过程中发挥着关键作用。长久以来， 用于构建皮肤组织工程的人源性种子细胞(毛囊干细胞、角质细胞、成纤维细胞等)主要来自于手术切除的皮肤、脂肪组织、新生儿包皮及毛囊等[2]，这些途径往往无法为皮肤组织工程提供足量、稳定的人源性细胞。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是通过4个转录因子OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc将已分化的体细胞编译而成的多能干细胞，该类细胞具有与胚胎干细胞相识的形态、基因、蛋白表达、增殖和分化能力[3]。诱导性多能干细胞来源丰富并且规避了人源胚胎损毁涉及的伦理方面的问题，在构建疾病模型、再生医学、药物研究及细胞毒性研究等多个领域展现出良好的应用前景，iPSCs向上皮分化能力也为其在皮肤组织工程中应用留下巨大的想象空间。因此，本研究将尿液细胞重编程为iPSCs，并诱导尿液细胞来源iPSCs分化为表达毛囊干细胞特异性基因的细胞(iPS-HFSCs)，为基于iPSCs的组织工程皮肤构建提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料：采集23岁健康成年男性的尿液作为实验标本，实验经浙江中医药大学附属江南医院伦理委员会同意(伦理审批号：10296)。人毛囊干细胞hHFSCs[Celprogen公司(货号36007-08)]；质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(plasmid #27077)、pCXLE-hSK(plasmin #27078)、pCXLE-hUL(plasmid #27080)和pCXWB-EBNA1(plasmin #37624)A(ddgene公司)(https://www.addgene. org/)。

1.1.2 试剂：Matrigel胶及6孔低黏附板(Corning公司)；mTeSR1培养基(StemCell公司)；Y-27632(MedChemExpress公司)；高糖DMEM(Life Technologies公司)；SingleQuot Kit CC-4127 REGM(Lonza公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、血清替代物(knockout serum replacement，KSR)、TrypLE Express、1%GlutaMAX、非必需氨基酸、β-巯基乙醇(Gibco)、两性霉素B、青霉素及链霉素(Gibco公司)；角质细胞无血清培养基(defined keratinocyte SFM，D-KSFM)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP-4)及bFGF(Thermo Fisher Scientificals公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸、维生素C、2腺嘌呤及维甲酸及Dispase Ⅱ(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 培养基：初始培养基：10%(V/V)FBS/高糖DMEM与含SingleQuot Kit CC-4127 REGM 1∶1混合物，添加2.5 μg/mL两性霉素B、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。肾上皮细胞培养基：SingleQuot Kit CC-4127 REGM含2.5 μg/mL两性霉素B、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。人胚胎干细胞培养基：DMEM/F12(1∶1)含20%(v/v)血清替代物、1% GlutaMAX、1%非必需氨基酸、100 μmol/L β-巯基乙醇和10 ng/mL bFGF。诱导培养基A：3∶1 DMEM/ F-12培养基含2% FBS、5 mg/mL胰岛素、0.5 mg/mL 氢化可的松、10-10mol/L霍乱毒素、1.37 ng/mL 三碘甲状腺原氨酸、0.3 mmol/L维生素C、24 mg/mL腺嘌呤和1 mmol/L维甲酸。分化培养基B：诱导培养基A添加25 ng/mL BMP-4和20 ng/mL EGF。分化培养基C∶D-KSFM含2% FBS、5 mg/mL胰岛素、0.2 mg/mL 氢化可的松、10-10mol/L霍乱毒素、1.37 ng/mL 三碘甲状腺原氨酸、0.3 mmol/L维生素C、10 mg/mL腺嘌呤和1 mmol/L维甲酸。分化培养基D∶D-KSFM含1 ng/mL BMP-4和20 ng/mL EGF。

1.2.2 尿液细胞的培养：收集200 mL尿液，室温下400 ×g离心10 min，弃上清，以含2.5 g/mL两性霉素B、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的10 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬残余尿样。离心弃上清，以1 mL初始培养基重悬尿液细胞。随后细胞接种到铺有0.1%明胶的6孔板，于37 ℃、5% CO2环境培养。接种后的前2 d，每孔每天补加500 μL初始培养基，之后以肾上皮细胞培养基进行半量换液。当观察到细胞克隆时，使用肾上皮细胞培养基进行隔日全量换液。当细胞达90%汇合时，使用TrypLE Express消化分离细胞，按1∶2～1∶3传代，取第3代尿液细胞进行转染。

1.2.3 由尿液细胞构建iPSCs系：电转染使用Amaxa Basic Nucleofector试剂盒，以T-020程序(250 V，10 ms，1，0.4 mm cuvette)进行。转染中每处理1×106尿细胞使用转染质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL和pCXWB-EBNA1各1 μg。核转后的细胞首先接种到铺有明胶的6孔板，以肾上皮细胞培养基培养5～7 d，随后转移到小鼠成纤维细胞(MEF)饲养层，以人胚胎干细胞培养基培养10～16 d，直到iPSCs克隆出现。用玻璃针收集iPSCs克隆并接种到铺有Matrigel胶的6孔板，以mTeSR1培养基进行扩增。每3～5 d使用TrypLE Express消化分离iPSCs，并按1∶3～1∶5进行传代。

1.2.4 尿液细胞来源iPSCs系鉴定：1)内源性基因检测：收集iPSCs后，根据TrizolTM试剂说明提取RNA，并使用Nanodrop检测RNA浓度。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒,根据说明书反转录RNA为cDNA。PCR反应条件为：94 ℃，预变性3 min；94 ℃变性30 s；退火30 s；72 ℃延伸，1 kb/min。35个循环，延伸10 min。PCR扩增所用内源性基因引物序列见表1，引物设计使用Primer Premier 6.0 demo和oligo 7.36 demo软件进行。取PCR扩增产物5 μL，以1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并以凝胶成像分析系统观测电泳结果及拍照。2)以碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性。

表1 RT-PCR扩增用引物

1.2.5 诱导iPSCs分化为毛囊干细胞:以mTeSR1培养基在Matrigel胶上培养iPSCs 2～3 d至60%汇合。用Dispase II孵育iPSCs 10～15 min，使iPSCs呈小团块分离，用DMEM洗涤两次，接种到6孔低黏附板中，加入2 mL人胚胎干细胞培养基，培养1～2 d形成拟胚体(EBs)。将新形成的拟胚体接种于3T3成纤维细胞饲养层，以诱导培养基A培养2 d。在分化培养基B培养4 d。在分化培养基C培养4 d。随后，用Dispase Ⅱ消化分离分化细胞，用TrypLE Express进一步消化成单个细胞。分离的细胞一部分接种于丝裂霉素C处理的3T3成纤维细胞上，以分化培养基D继续培养7 d。分化11 d时细胞能以团块从饲养层分离，从而更容易去除饲养层污染细胞。因此收集分化11 d的细胞进行后续的检测。

1.2.6 iPSCs来源毛囊干细胞的鉴定和iPS-HFSCs基因表达分析：采用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix试剂盒进行定量RT-qPCR，每次反应使用0.5 μL cDNA样品。所有反应均在ABI 7500fast仪器进行，并通过ABI Relative Quantification Study software进行分析。RT-qPCR使用人毛囊干细胞及iPSCs作为对照，以管家基因GAPDH作为内参，并经过至少3次独立分析验证。RT-qPCR采用2-△△Ct法计算相对基因表达量。

1.3 统计学分析

以两因素析因设计资料的方差分析或成组设计资料的t检验，采用Graphpad PRISM version 7.04统计软件对所得数据进行数据的统计学分析。

2 结果

2.1 iPSCs系的构建及检测

第3代尿液细胞呈现纤维样或上皮样，状态良好(图1A)。核转后7 d左右观察到尿液细胞发生形变，25 d左右出现具有人胚胎干细胞特异形态的iPSCs克隆。可见克隆团边界清晰，细胞紧密，细胞核大，形态类似于胚胎干细胞(图1B)。碱性磷酸酶染色显示，尿液细胞来源的iPSCs克隆呈阳性(图1C)，显示该细胞呈未分化状态。RT-PCR(图1D)结果证实尿液细胞来源iPSCs内源性多能性基因SIX2、KLF4、OCT4和c-Myc的激活，进一步验证尿液细胞来源iPSCs的多能性。以上结果表明，具有类似于胚胎干细胞分化能力和基因表达的iPSCs系已建立。

2.2 iPSCs来源的毛囊干细胞的构建及检测

iPSCs团块悬浮培养1～2 d，可见拟胚体形成(图2A)，接种到3T3饲养层2 d后，可见细胞从拟胚体边缘爬出(图2B)。分化11 d，爬出的细胞呈紧密的多角形，与iPSCs具有显著差异(图2C)，分化18 d细胞呈现表皮干细胞特异性的铺路石形态(图2D)。

A.morphology of urine cells; B.iPSCs exhibiting ESC-like morphology in coculture with mouse embryonic feeder fibroblasts(scale bar=100 μm); C.alkaline phosphatase staining of iPSCs(scale bar=100 μm); D.RT-PCR for expression of OCT4(endo), SOX2(endo), KLF4(endo), and c-Myc(endo) in iPSCs and parental urinary cells

A.embryoid body; B.morphology of embryoid body after inoculation; C,D.morphology of iPSCs after 11 and 18 days of differentiation; scale bar=100 μm

免疫荧光检测细胞中毛囊干细胞特异性标记(CD200、ITGA6、KRT15和KRT19)的阳性表达(图3A)。iPSC-HFSCs的RT-qPCR分析显示人毛囊干细胞特异性基因(CD200、KRT15、KRT19和ITGA6)高表达(图3B)，而未分化基因(REOX1、NANOG和OCT4)表达下调(图3C)。以上结果与人毛囊的细胞相似，但与iPSCs有显著差异，表明诱导11 d后iPSCs分化为表达毛囊干细胞标记物的细胞。

3 讨论

iPSCs具有无限增殖和全能性分化特性，在生物医学领域具有广阔的应用前景。人成纤维细胞，人角质细胞[4]、人脐带血细胞[5]以及脂肪来源细胞[6]等均可重编程为iPSCs，同时人尿液细胞也可被编译为iPSCs[7]。人体肾小管网络庞大，每天有2 000～7 000个细胞从尿道、输尿管上皮、膀胱、肾小管上皮脱落，并随尿液排出体外[8]。这些细胞大部分保留有正常的功能且容易获得，是进行体外研究的理想细胞来源。采用c-Myc、KLF4、SOX2和OCT4转录因子诱导iPSCs是最经典的编译方法，利用4转录因子对体细胞重编程的稳定性和高效率。采用更为安全的非整合的重组质粒电转法，获得到了健康人iPSCs株，这排除了iPSCs产生插入突变的可能，简化操作的同时提高了转染效率。

iPSCs的分化受多种生长因子调控，骨形态发生蛋白4(BMP-4)能够诱导多能干细胞上皮分化，并通过Smad信号通路阻断神经分化，BMP-4诱导胚胎干细胞分化为角质细胞[9]。而维甲酸(retinoic acid，RA)和表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)能够同时激活外胚层和中胚层标记，并被用来诱导多能干细胞分化为外胚层和中胚层细胞[10]。其中RA具有诱导双向分化的能力，当神经外胚层命运已确立，RA常常被用来作为神经分化的诱导因子，而当神经分化被阻断，RA能诱导上皮细胞分化[11]，因此能够显著提高角质细胞扩增的效率。联合应用BMP-4和RA信号通路已被证实能诱导iPSCs分化为角质细胞[12]。随后发现添加表皮生长因子能显著提高iPSCs来源角质细胞的分化率和扩增效率，使得获得足量iPSCs分化细胞用于在皮肤组织工程成为可能[13]，而精确调控EGF信号通路能让分化中的iPSCs停留在上皮分化的早期阶段[14]。

A.immunofluorescence analysis showing positive expression of KRT15, KRT19, ITGA1, and CD200, scale bar=30 μm; B,C.RT-qPCR analysed of hair follicle stem cell-related genes (KRT15, KRT19, CD200 and ITGA6) (B), and pluripotent genes (REOX1，NANOG and OCT4)(C) in cells induced for 11 days compared with control hair follicle stem cells (hHFSCs) and iPSCs

本研究中，经过11 d的诱导，获得了具有毛囊干细胞特异性多边形形态的细胞，这些细胞表达毛囊干细胞特异性基因。结果说明，由诱导iPSCs获得了细胞类似毛囊干细胞特性，这为皮肤组织工程提供了新的种子细胞来源，也为基于iPSCs分化细胞的组织工程构建提供参考。