病证结合动物模型研究概述＊

王靖怡，高嘉良，王 阶

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

目前,病证结合是中医临床诊疗的重要模式，强调临床诊疗过程中既重视西医疾病的诊断，又注重中医证候的认识[1]。中医药要实现质的飞越，与世界接轨，需要继承发展、守正创新，在中医药理论内涵、作用机制、疗效评价及新药研发等多个环节获取有力佐证。在中国悠久的历史长河中，中医药临床疗效显著有目共睹，但如何从基础研究对其有效性进行验证仍是亟需攻克的关键难题。有鉴于此，研究者将目光转向病证结合动物模型这个重要载体，其也日益成为中医实验动物模型的研究热点而广受关注，故本文对目前病证结合动物模型研究概况进行了简要梳理。

1 病证结合动物模型是实现中医药现代化发展的关键

西医学之“病”以西医理论体系为基础，聚焦人体细胞、组织、器官等结构与功能方面的病理变化，从全程和特征上认识疾病本质[2]，并以此为治疗依据[3]。“证”是中医学特有的概念，作为疾病的“横断面”，反映疾病发生发展过程中某一阶段的病理本质，涵盖病因、病位、病性、病机、病势及虚实邪正等方面内容，强调与疾病相关的各种因素共同作用于机体所体现的整体反应特性[3]。“病”“证”结合临床诊疗及科研模式是中西医学两种体系的结合，旨在融合疾病与证候体系，研究疾病的发生、发展规律，便于指导临床防治疾病[4]，其优越性早在朱肱的《南阳活人书》中就有所提及：“因名识病，因病识证，如暗得明，胸中晓然，无复疑虑而处病不差矣。”

证候是中医学的理论核心，辨证论治是临床治疗的基础。证候不仅是对临床现象的归纳总结，更是联系中医理论与临床实践的关键枢纽。“有诸内必形诸于外”，证候的外在表现为四诊宏观信息所体现的具有规律性的病理生理过程，而其内在规律性的物质基础尚待进一步挖掘[5]。证候实质的揭示不仅能够促进辨证论治的客观化与科学化，更是实现中医药现代化，与世界接轨的必经之路，而病证结合正是证候本质研究的关键手段之一。在探寻证候实质和深化机制认识等方面，动物模型都是重要的工具和手段[6]。病证结合动物模型的建立旨在探索病理生理变化与证候特征之间的关联，从基础研究的角度为中医药疗效发声，提供客观有力的支持与依据，在中药筛选、机制研究、新药开发乃至中西医理论深层次的探讨等方面都具有重要意义[7]。

2 病证结合动物模型在研制思路上不断创新

自20 世纪60 年代邝安堃制备出首例中医阳虚动物模型以来[8]，至今已有上百种证候动物模型建立[9]。单纯的中医证候造模多从病因入手，将中医认为造成“证候”形成的原因施加于动物，以求造成与患者表现相同或相似的“证候”。然而，单纯的中医病因对于中医病证来说多为诱发因素，而非直接发病因素，往往不具备特异性，与个体敏感程度、施加强度及作用时间等密切相关，因此模型的稳定性和代表性相对薄弱。西医常规动物造模基于明确且特异的病理损害，其稳定性高、可重复性好，方法较为成熟，但缺乏中医辨证思想，模型动物的病理状态往往较难与中医特定证候对等[10]。结合二者各自的特点及优势，病证结合造模方法应运而生，其在研制思路上不断进行创新与融合，具体如下文。

2.1 中西医结合多因素复合造模

以中医药理论为基础，结合现代医学及实验动物学相关知识，分别或同时采用中医病因病机（如六淫、饮食、劳倦、情志等）复制证候模型，现代医学病因复制疾病动物模型，使模型动物同时兼备疾病和证候的特征[11]。有研究[12]通过高糖高脂饲喂联合游泳致力竭模拟中医病因，联合腹腔注射丁胺卡那霉素和链脲佐菌素模拟西医病因，使模型大鼠符合2 型糖尿病脾肾气虚证病证结合动物模型的评估标准。由于该模型可有效模拟临床疾病与证候之间的病理对应关系，因此已广泛作为研究载体进行临床病理及证候本质的研究，并逐渐成为中药新药判定客观疗效和探讨药理作用的重要手段[13]。亦有学者[14]利用高脂饲养联合冰柜冷藏，结合皮下注射脑垂体后叶素（pit），建立冠心病阳虚血瘀证大鼠模型，通过观察动物整体活动表现及血脂、心肌酶、心电图、心脏彩超等检查，以及温阳活血药物干预进行反证，多环节论证模型与临床的一致性。

2.2 西医疾病模型基础上探寻中医证候

病与证候不可完全割裂看待，证候并非游离于疾病之外，也非施加中医病因才出现中医证候，而是在疾病发展过程中同时存在中医证候的变化[15]。该模型是在西医疾病模型的基础上，未施加任何其他外在人为干预因素，在成模过程中或成模后，宏观、微观相结合，动态观察并采集实验动物症状、体征及实验室指标，综合分析并归纳疾病形成过程中“证候”的动态演变过程、特点，以及成模后所表现的中医证型，从而确定某一特定的病证结合模型。有研究者[16]应用免疫造模法模拟人类免疫性血小板减少性紫癜，结果显示模型符合由急性发病的热证转化为慢性发病的气虚血瘀证的临床实际情况。亦有相关研究[17]通过对自发性高血压模型大鼠（SHR）早期中医证候属性进行行为学研究及宏观表征观察，发现SHR 早期中医证候与人类高血压肝火上炎证相似。还有研究[18]采用夹尾、禁食水、冰水强迫游泳、噪音刺激、限制行为等多种刺激类型，随机安排建立抑郁症大鼠模型，根据大鼠表征和行为学检测判定为肝郁脾虚证型。

2.3 证候模型基础上探寻西医疾病类型

该模型建立首先依靠中医传统病因造模方式对动物进行初步环境因素模拟，通过观察宏观表征、检测理化指标以及代表性方药反证等方式，初步确立证候动物模型，在此前提下，寻找具有关联性的临床疾病进行验证[19]。有研究[20]采用大黄煎煮液灌胃联合夹尾、番泻叶煎煮液联合束缚的方法建立肝郁脾虚证候大鼠模型，通过比较大鼠造模前后体质量变化、给药后排稀便时间等来评价该模型是否与现代医学中的肠易激综合征表现一致。

3 规范化与标准化问题仍面临巨大挑战

3.1 从多因素着手建立规范化病证结合动物模型

选择何种动物进行人体病证的延伸模拟，是实验研究的首要步骤。任何实验动物都是研究过程中不可缺少的“最精密的实验仪器”[21]，实验动物的选择与模型的制备关系密切，因此在制备过程中应尽量选择与人体相似度高，对造模因素敏感性高，模型特征出现迅速、稳定且持久，同时易于满足所研究病证相应特征的实验动物[22]，以便于更好地模拟复制人类病证。例如，小型猪循环系统与人类相似，适宜于复制心血管相关病证[23-24]；大鼠及小鼠因易获取、低成本、相关研究多、研究者熟悉程度高等因素，成为目前较为常用的造模动物。另外，同一证候模型造模动物选择差异较大，如脾虚证模型制备选取动物有大鼠、小鼠、豚鼠等[25]。由于不同品系、不同性别实验动物，对造模因素的耐受及敏感程度不同，同等强度作用于不同种系、不同生长阶段的动物所造成的效果也不尽相同。这是模型可复制性相对较差的主要原因之一。因此，在纵向进行同一病证造模的同时，运用比较医学的思想，横向探索不同种系动物模型之间的相似度与差异性，从而筛选建立不同病证结合模型最适宜的造模动物选取标准。在进行相关病证结合动物模型系统评价时，可借鉴采用GRADE 对证据体进行分级评价，有利于提高临床实践与动物实验结果相互印证的可行性[26]。

此外，病证结合动物模型并非凭空想象组合，所要构建的病证模型需在临床上确有关联，具有发展阶段的同步性，同时需要满足两者的结合点易于发现，这样才有可能作为深入探讨病证结合机制的切入点进行研究，如临床已证实冠心病与血瘀证的关系密切等。

造模因素的选择对于构建规范化的病证结合动物模型也至关重要。目前，病证结合动物模型存在的主要问题是同一证候存在多种造模方法，如脾虚证模型造模因素中，中医病因造模就包括苦寒泻下、饮食失节、限制营养、耗气等，若联合现代医学方法，采取单因素或复合因素方式构建，则种类更多，据统计可多达24 种[27]。目前尚缺乏何种造模因素能造出典型的符合临床实际的中医证型的相应规范。有鉴于此，可以结合临床导致证候出现的主次原因，适当优化造模因素，使其同时符合中医发病规律和临床发病实际进程。同时，还可对同一证型的多种造模方法进行横向比较，筛选建立最佳的构建模型的造模因素。

3.2 构建标准化评价体系至关重要

模型动物造模成功与否关键取决于对模型的评价。目前大多数病证结合动物模型缺乏合理的标准评价体系和方法。基于这种现状，可以考虑从以下两方面入手。

第一，宏观表征与微观指标对接，构建人与动物四诊转换模式。由于人与动物在解剖结构、生理病理等方面都存在一定的差异，因此证候转换的问题不容忽视。一方面可以充分挖掘动物自身有助诊断的症状信息特点，寻找其与人的相似性，便于辨证分析；另一方面可以基于理论及临床研究，总结一切能够具体反映“证候”特点的生物标志物或宏观表征，有机对接嵌构于动物模型评价体系中。目前已有相关研究在大鼠、小鼠和小型猪四诊信息（半）客观化方面取得一定的进展，如大鼠、小鼠四诊工作站的建立可以实现定量化、标准化的采集和评价[28]。

第二，结合有效经典方药反向验证。利用方证相应理论，逆向应用“有是证用是方”治疗思路进行反向验证，通过用药后症状、体征及相应实验室指标的改善来证明模型动物的证候属性。这可以进一步说明病证结合模型的科学性和合理性。

4 多学科交叉与大数据兴起或将带来机遇

4.1 从系统生物学寻找模型标志网络

系统生物学是当前研究生命复杂系统较为公认的思维方式和研究手段，有利于揭示中医证候的非线性复杂巨系统[29]。系统生物学通过整合多种组学信息，研究一个生物系统中的所有组分（如基因、mRNA、蛋白质及代谢物等）在特定条件下（如遗传、环境因素改变等）的相互关系，进而实现从微观基因、细胞、组织到宏观个体的多方向、多层次研究，以解析生命复杂过程的本质规律[30-31]。系统生物学整合思想观念与中医“整体观念”和“辨证论治”核心不谋而合，将其应用于探寻证候本质的研究，有可能从完整的疾病分子角度去诠释证候的核心，帮助我们更好地理解证候实质，从而实现证候理论客观化、定量化的科学诠释，这也是中医药现代化、国际化发展的重要路径。

单一组学在中医证候研究领域的应用已较为广泛，但仍需明确的是，组学本身并不能等同于系统生物学，而是要以系统模型为指向，结合生物信息学、系统控制等方法，针对证候的“外延”与“内涵”通过计算模型获得规律性认识，从而产生与试验结果相一致的系统模型[32]，否则单纯的组学只不过是大规模的还原分析[33]。目前，已有相关中医证候的网络模型构建研究，如Li S 等[34]采用文献挖掘、网络分析及拓扑比较等方法，采用“相互作用-网络-功能”研究策略，构建出基于“神经-内分泌-免疫”网络相互作用下的中医寒热证网络模型。这些网络模型的构建可以有机建立起从人转向动物模拟的生物学标志,为关键病理调控节点的发现提供线索，也为病证结合动物模型评价体系的构建做出贡献。

表型组学（phenomics）[35]概念的提出也为证候的生物学基础研究提供了新视角，帮助识别判断证候所依赖的主观症状的生物学基础。这些研究将有助于科研工作者整体、全面地印证中医证候动物模型的有效性及科学性，推进中医理论的探索研究，深入“证候”本质[36]，在证候与生物学指标之间有机构建相对稳定的网络，有助于阐明中医证候与疾病的生物学关系。

4.2 现代科学技术交叉助力模型构建

有学者[37]提出，潜变量分析可以在分析过程中引入无法直接观察、需经测量推断的指标或变量，这与中医证候的特点具有某些相似之处，因此有学者通过潜变量分析作为病证结合动物模型构建思路进行相关研究[38]。此外，Swanson教授提出一种基于非相关文献知识发现的方法，可通过寻找隐藏关联用于知识发现[39]。该方法可应用于两类不相关的疾病文献中寻找可能的相关因素，这与中医“异病同治”思想存在一定的关联。该方法可以应用于“方证相应”理论研究，挖掘同一方剂主治疾病谱存在的共同病理环节，并据此选择典型的病因进行造模，使关键病理环节所致典型临床特征得以在动物模型上实现。此外，贝叶斯网络技术、复杂网络和卡方自动交互检测决策树、决策函数、人工神经网络等信息挖掘及人工智能手段也为更好地建立病证结合生物信息网络，辅助动物模型的构建提供支持。

5 结语

尽管在病证结合动物模型领域已有诸多创新，并取得了一定的成果，但仍有许多问题尚待解决。尤其是规范化和标准化等问题，有赖于革新的技术手段和前沿的科学知识等诸多条件。因此，科研工作者要摆脱“一次成型”的思想。模型不能完全等同原型，只要能够实现模拟原型实质并反映研究目的就是适合的模型，因此，在研制观念上不应苛求每个模型都精准、全面、系统地覆盖和表达临床病例实体原型，毕竟病证在人体的表现形式也是千差万别的。在评价体系的建立和完善过程中也应给予一定的时间，任何一种评价方法学的建立都需要在发展的过程中不断去探索修正和改进完善，绝不可能一蹴而就。尽管病证结合动物模型之路道阻且长，但新知识、新技术的高速革新与更迭，一定能够为其注入新的生机和活力，更有效地助力证候乃是中医药疗效实质的揭示。