子宫内膜异位症动物模型制备方法研究概况

孙瑞英，崔轶凡

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是一种具有活性的子宫内膜组织在宫腔被覆盖的黏膜外生长的雌激素依赖性疾病。在中医学里并无EMT的病名，根据其临床表现，本病多归于“不孕症”“月经病”“癥瘕”等范畴。目前对于该病的发病机制尚不清楚，且手术及西药治疗效果不彻底，具有较高的复发率，极大地降低了患者的生活质量。由于伦理学等方面的原因，很难在EMT患者身上观察发病的全过程，不能对人类进行对照研究，也不能进行损伤性研究。因此，创建理想的动物模型模拟人类EMT，有助于进一步研究其病因学、治疗学，对明确其发病机制、研发治疗新药、探索中药作用机制均起到了不可或缺的作用，有益于尽快攻克该疾病。

EMT动物模型的复制，虽然取得了阶段性进展，但由于EMT的发病机制尚未完全阐明，给模型的复制也带来了一定的困难。并且EMT动物模型存在一些急需解决的问题，不同动物模型适用范畴和潜在的限制性都要充分考虑。本研究总结近20年来EMT动物模型的发展经验，对各种EMT动物模型的现状和问题作出简述。

1 EMT动物模型造模方法

1.1 自发性

除人类外，只有雌性灵长类动物，包括恒河猴、狒狒、南美猕猴等会出现天然自发的EMT。它们具有规律的月经周期和子宫内膜脱落过程，与人类的月经、性周期和妊娠现象相似，是理想的EMT模型动物。挑选具有规律的月经周期及生育能力的雌性灵长类动物，通过腹腔镜排除无EMT的动物用于实验。1991年，D′Hooghe TM等［1］通过腹腔镜检查发现狒狒自发性EMT，且其组织学方面和骨盆病变的位置与女性相似，是用于研究EMT的良好动物模型。2017年，Gruber-Dujardin E等［2］选取自发性EMT猕猴模型研究子宫内膜异位的形态和免疫组化特征。然而，非人灵长类动物自发性EMT周期长且概率很低，约为1%［3］，一般都采用人为诱导产生EMT模型。

1.2 诱发性

诱发性是利用手术把自身子宫内膜移植到宫腔之外的部位，或者封闭其宫颈或阴道口，使其经血逆流进入腹腔，最终导致疾病的发生。诱发性非人灵长类动物模型与自发性模型相比，具有实验周期短、成模率高的明显优势，并能耐受多次手术操作。虽然非人灵长类动物在EMT研究中具有自身特有的优势，但在现实操作中，灵长类动物数量较少且价格昂贵，不适合用于科学研究。目前我国广泛采取的是诱发性造模方法，此类方法普遍适用于非人灵长类和啮齿类动物。

2006年，Hastings JM等［4］采用自体内膜手术移植的方式，将狒狒子宫内膜接种到腹腔导致子宫内膜异位病变的发展，发现其形态特征与人类相似。Harirchian P等［5］利用手术将狒狒的子宫内膜种植到腹膜内，成功诱导狒狒形成EMT。D′Hooghe TM等［6］采用阻塞宫颈方法，导致狒狒的逆行月经量增加，最终参与实验的5只狒狒均发生EMT。采用手术诱导病灶形成与阻塞宫颈或阴道口模仿经血逆流人工诱导EMT相比，其具有操作简单、可控性较好的特点，故实际实验中多选用手术自体内膜移植诱导非人灵长类动物形成子宫内膜异位病灶。目前国内关于非人灵长类诱发EMT动物模型报道较少。2003年，宗利丽等［7］采用手术将猕猴的子宫内膜移植到盆腔宫腔以外的部位成功建立了EMT模型。2015年，朱峰城等［8］选取食蟹猴采用自体内膜移植成功诱导了EMT模型。

啮齿类中常用动物为大鼠、兔。大鼠为多发情动物，发情周期短，有超强的生命力，可经受多次手术，性成熟早，能够迅速孕育出后代，且成本较低，普遍适用于科学研究。常用的有Wistar大鼠和SD大鼠，造模原理多依据EMT种植学说进行自体内膜移植诱导。能够进行自体内膜移植的部位很多，如腹壁、肠系膜、卵巢附近等，多选择在腹壁处进行移植，方便操作且不易形成粘连［9-10］。SD大鼠与Wistar大鼠对比，其对性激素的感受性更高，体质更强，造模成功率更高。聂晓博等［11］采用自体内膜种植法制备EMT SD大鼠模型研究莪术醇对EMT大鼠腹腔液中炎症因子的影响。黄艳辉等［12］成功构建了EMT Wistar大鼠模型来探讨温经止痛方对EMT大鼠AKT/mTOR通路相关分子表达的影响。但有研究发现采用自体内膜皮下移植法更有优势，认为皮下种植法操作简单，观察直观，避免二次开腹，便于实验研究［13］。此外，在查阅大量文献过程中发现实验中多选用动情期大鼠的子宫内膜进行移植造模，但有研究发现选用非发情期或发情期的大鼠进行造模，两组造模的成功率并无显著区别［14-15］。因此，可取消动情周期的监测，直接造模，这样不仅有利于实验的同步性，还可以减少实验的周期。

兔为刺激排卵动物，无发情期、月经，以诱发性EMT模型为主。1980年，Schenken RS等［16］选用兔采取自体内膜移植成功诱导了EMT模型，并发现其异位灶能持续长达12周。2010年，Rosae-Silva JC等［17］采用自体内膜移植成功构建了兔EMT模型，并发现其异位病灶的增殖指数比在位内膜高，与人体EMT的前期研究相似。2016年，Saad-Hossne R等［18］对兔进行手术诱导构建腹膜EMT模型，研究20%阿司匹林注射液在实验性腹膜EMT中的治疗效果。兔不仅具有价廉、成功率高及体型适于手术操作等优点，还拥有完整的内分泌和免疫系统，不需要补充外源性类固醇激素。不足之处在于其异位病灶形成时间较长且刺激反射性排卵控制困难。

1.3 种植性

1.3.1 同种异体种植 在一种动物腹腔中种植同一种或与之基因相同的动物子宫或子宫内膜，称为同种异体种植。常用啮齿类大鼠和小鼠作为实验载体。张薇等［19］对24只Wistar雌性大鼠行异体子宫组织移植手术，30只行自体子宫组织移植手术，结果Wistar大鼠异体移植成模率（83.3%）高于自体移植成模率（76.7%）。崔金秀等［20］采用同种异体皮下移植法成功建立了大鼠EMT模型。

小鼠体形小，易于控制，生长繁殖快，基因与人类高度相似，遗传背景清晰，对于雌孕激素较其他啮齿类敏感，且已培育出大量的近交系、封闭群和转基因动物，给EMT的研究提供了更丰富的资源，常用有BALB/c、C57BL/6等。Somigliana E等［21］通过在具有免疫能力的C57BL/6和BALB/c小鼠中采用同种异体移植成功构建了EMT小鼠模型，适用于探讨使用免疫系统疗法治疗EMT的可能性。崔阳阳等［22］通过“腹腔+皮下”同种异体子宫内膜注射法成功建立了EMT小鼠模型。李冰冰等［23］采用腹腔注射含供体小鼠子宫碎片的生理盐水法成功建立BALB/c小鼠EMT动物模型，操作简便、成模率高，异位病灶有纤维化生成，可作为EMT纤维化机制和药物疗效研究的可靠动物模型。

1.3.2 异种种植 将人的子宫内膜组织或EMT病变植入到具有免疫缺陷的小鼠体内，构建EMT模型，称为异种种植。常用的动物为具有免疫缺陷的裸鼠和SCID小鼠，无异种移植免疫排斥反应，成模率高。裸鼠是T淋巴细胞功能缺陷的动物，B细胞功能基本正常。把人的子宫内膜移植于裸鼠体内后，能够维持固有的组织形状和生化特性，基本保存了其遗传学，对各种药物的敏感性不会发生变化［24-26］。而SCID小鼠同时具备先天性T、B淋巴细胞联合免疫缺陷，是严重联合免疫缺陷动物，较裸鼠可以更好地克服异种间的免疫排斥反应，接受人类正常或肿瘤组织移植，使得移植后的组织仍保持原有组织形态及生化特征。但裸鼠和SCID小鼠抵抗力差，手术过程中易死亡，不能用来研究免疫、炎症相关方面的机制。

组织块种植模型被广泛使用，但容易产生炎性囊肿，进而导致盆腔微环境受到影响，在移植时组织块比较小，实验历程繁琐，降低成模率。与组织块移植模型相比，细胞移植接种便利，细胞类别明晰，成模率较高。Banu SK等［27］将EMT患者的子宫内膜细胞注入裸鼠腹腔，形成EMT病灶，造模成功率为100%。有研究表明SCID小鼠的建模形成率远远高于裸鼠，4周后观察病灶仍保持其固有的内膜组织形态［28-29］。

2 EMT动物模型的分类

2.1 病证结合动物模型

随着中医学的发展，将病与证结合起来构造动物模型逐渐受到了研究者的青睐。崔阳阳等［30］为了使动物模型的辨证更具备切实性，运用中医四诊辨证的基础上，根据辨证结果采取“以方测证”的措施来进一步证明动物造模是否成功。崔轶凡等［31］运用“寒凝血瘀、堕胎伤肾”中医病因理论成功构建了肾虚血瘀型EMT大鼠模型，并采用《金匮要略》温经汤加减和《傅青主女科》调肝汤以方测证进一步评判所建造的肾虚血瘀型EMT动物模型。贾云波等［32］模拟妇科“冒雨涉水，感受寒邪”的病因，依据“寒邪伤阳”的中医理论，与传统的“自体移植”EMT动物模型相结合，建立病证结合的肾阳虚血瘀证EMT动物模型。运用病证相结合的动物模型，更加符合中医疾病发生的特点，且具有一定的定量性和客观性，为中医与世界接轨奠定了坚实的基础，成功跨出了飞跃性的一步。

2.2 EMT体外三维模型

现有的EMT体外模型的主要局限性在于它们采取二维模型，即通过在组织培养上以单层形式培养内异症上皮细胞而建立的模型。近年来，三维模型逐渐成了新的研究方向，三维模型在二维的基础上引进了细胞外基质，为多方向细胞生长创造了微环境，从而可以更完美地察看细胞的侵犯性，再现异位子宫内膜细胞的局部粘连、侵袭和迁移过程，有利于EMT发病机制的研究。Tsuno A等［33］构建的体外EMT基质细胞培育模型，为探索内膜细胞与基质细胞间的彼此影响机制提供了更好的平台。Mehasseb MK等［34］在体外三维模型的创建中，发现基质细胞浸润的深浅受到子宫肌层细胞的影响，揭示EMT的发病与子宫肌层可能有关。Brueggmann D等［35］以聚甲基丙烯酸2-羟基乙酯作为支架，建立体外三维培养模型，所采用的子宫内膜异位表皮细胞系16与12Z于组织形态学和基因表达方面与EMT表现更相似。

2.3 荧光EMT动物模型

目前，荧光EMT动物模型在EMT的基础研究方面应用日益广泛。EMT动物模型的光学成像技术主要采用荧光染料法和荧光素酶生物发光，如荧光染料标记内膜、基因转染以及荧光转基因动物在体内膜进行构建EMT动物模型［24］。刘斌等［36］成功采用Ad-eGFP转染人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞混悬液建造了裸鼠皮下人EMT活体荧光观察模型，形成率高，体外荧光时间更长。袁华等［37］构建了一种可以使学者们于同一动物体内利用绿色荧光蛋白在一定时段内非侵入性动态监测EMT病变发生发展情况的EMT动物模型，为EMT病因及治疗的研究提供有效的工具。关绮蕙等［38］运用慢病毒载体将荧光素酶和红色荧光蛋白基因转入内膜组织并培养48 h，将等体积的人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞混悬液注射到BALB/C雌性裸鼠腹腔内，成功构建了人子宫内膜异位症的可示踪裸鼠模型。

疾病的发生常是由于六淫、疠气、七情、饮食、劳逸、创伤等多方面因素相互作用的结果，说明引起疾病的原因具有复杂多样性。因此采取多因素造模方法，更有可能复制出与临床疾病证候相符的动物模型。造模过程中首要分析该证候病因的主次，严格监控各项因素，保障动物模型的的一致性和统一性。

体外三维模型在研究细胞的增长、黏附、侵袭性以及不同细胞之间的相互影响方面比体内模型有着更明显的优势。构建EMT体外三维细胞模型有助于保持内膜细胞的生物学特征，更好地仿制致病的微环境，察看细胞的生长状况，但体外三维模型在EMT远处迁移特点的观测方面有着一定的限定性，另外检测系统有待进一步完善。EMT动物模型通过荧光转染技术建立，虽然其定位准确，但目前无定量植入和观察病变的客观标准。其荧光表达时间可持续长达4周，却仅限于EMT早期相关的研究。再者荧光表达灵敏度高，特异性好，适用于异位病灶的探测观察与研究，但不宜用于盆腹腔深部病灶的观察。

3 小结

在体研究的局限性推动了动物模型的多样化，构建可重复的、可控的EMT动物模型是研究EMT的发病机制、治疗方法以及药物疗效评价的主要实验载体。各种动物模型在EMT的研究中各有特点，但同时存在一些问题，不能完全满足实验需求。如采用动物模型的品系不统一，建模时间不同步，延误了整个实验的建模时间，导致模型的完成、药物的给予、病变的观察以及材料的提取等具有不均一性，为实验增加了非处理因素，使得模型在效果上存在一定的差异，进而导致实验结果不能受到国际上广泛认可。在以后的EMT动物模型研究中，我们应该逐步形成一个完善的评价系统，以中医理论为支撑，运用多学科知识采取现代化手段建造合适的EMT动物模型，为研究EMT构建一个与临床实际更贴切的实验载体。