慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平与牙周指标、炎性细胞因子及蛋白酶相关分子的相关性研究*

罗业姣，龚仁国，陈 齐，张 静，王君莲

(成都医学院第一附属医院口腔科,四川成都 610500)

慢性牙周炎是口腔科的常见疾病，表现为牙周组织慢性炎症性破坏，严重危害口腔健康，同时也是导致成年人牙缺失的主要原因之一。牙菌斑被认为与慢性牙周炎的发病密切相关，其可引起牙周组织炎性反应激活[1-2]，但牙菌斑激活炎性反应的机制仍不明确。近年来，微小RNA(miR)在多种炎症性疾病中的作用受到了越来越多的关注[3-4]，其中miR-146a已经被证实在慢性牙周炎患者的唾液中存在异常表达，并且与多项牙周指标、炎性细胞因子均存在相关性[5]；miR-21则被证实在侵袭性牙周炎中存在异常表达[6]，但国内关于miR-21在慢性牙周炎中的变化及意义鲜见报道。为此，本研究拟分析慢性牙周炎唾液中miR-21水平与牙周指标、炎性细胞因子及蛋白酶相关分子水平的相关性，旨在阐明miR-21在慢性牙周炎发生及病情发展中的作用，进而为将来探究慢性牙周炎发病机制，寻找慢性牙周炎新的诊疗靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年3月至2019年3月本院收治的50例慢性牙周炎患者作为慢性牙周炎组，纳入标准：(1)经临床判断为慢性牙周炎且至少一颗牙探诊深度超过5 mm；(2)首次诊断，入组前未接受过牙周治疗；(3)临床资料及唾液标本完整。排除标准：(1)合并慢性咽炎、扁桃体炎等口腔局部炎症；(2)近3个月接受过抗菌药物、免疫抑制剂治疗；(3)合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病。选择同期体检的50例健康志愿者作为健康对照组。慢性牙周炎组中男29例，女21例；年龄34～59岁，平均(44.58±8.12)岁。健康对照组中男27例，女23例；年龄33～60岁，平均(46.17±9.67)岁。两组间一般资料的比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究取得研究对象的知情同意及本院伦理委员会批准，审批号为伦审(H20151223)。

1.2仪器与试剂 miRNA提取试剂盒、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒购自北京康为世纪公司，白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-8、MMP组织抑制物-1(TIMP-1)的酶联免疫吸附试剂盒购自上海西唐公司。

1.3方法

1.3.1唾液标本的收集 慢性牙周炎组在治疗前进行标本收集，健康对照组在体检时进行标本收集，晨起后用蘸有2%枸橼酸的棉签擦拭口腔，然后用1.5 mL的EP管收集唾液约1 mL，在4 ℃离心机中3 000 r/min离心15 min，取唾液上清并分为两份，放置在-80 ℃保存。

1.3.2唾液中miR-21表达水平的检测 取一份唾液标本，采用miRNA提取试剂盒提取标本中的miRNA，采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒将miRNA反转录为cDNA，采用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒对cDNA中的miR-21及U6进行荧光定量PCR扩增，miR-21的上游引物序列为5′-TAGCTAGCGTAGCTAGCT-3′，下游引物为试剂盒通用引物；U6的上游引物序列为5′-GCATGTAGCTAGCTAGCTAA-3′， 下游引物序列为5′-TGCTAGCTTAGCTAGAACTG-3′。PCR程序为95 ℃预变性5 min后95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s重复40个循环，反应完成后在软件中自动生成循环曲线及循环阈值(Ct)，以U6为内参、计算miR-21的表达量，用2-ΔCt法计算，ΔCt=CtmiR-21-CtU6。

1.3.3唾液中炎性细胞因子及蛋白酶相关分子的检测 取另一份唾液标本，采用酶联免疫吸附试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-1、MMP-8、TIMP-1的水平，均按试剂盒说明书进行操作。

1.3.4牙周指标的检测 由主治医师级别以上的医生进行牙周指标的检测，具体指标包括菌斑指数(PLI)、牙龈指数(GI)、牙周探诊深度(PD)、附着丧失(AL)。

2 结 果

2.1慢性牙周炎组与健康对照组唾液中miR-21表达水平比较 健康对照组唾液中miR-21的表达水平为0.95±0.18，慢性牙周炎组唾液中miR-21的表达水平为2.11±0.52；与健康对照组比较，慢性牙周炎组唾液中miR-21的表达水平明显升高，差异有统计学意义(t=14.906，P<0.001)。

2.2慢性牙周炎组与健康对照组牙周指标比较 与健康对照组比较，慢性牙周炎组的PLI、GI、PD、AL均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 慢性牙周炎组与健康对照组牙周指标比较

2.3慢性牙周炎组与健康对照组唾液中炎性细胞因子水平比较 与健康对照组比较，慢性牙周炎组唾液中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 慢性牙周炎组与健康对照组唾液中炎性细胞因子水平比较

2.4慢性牙周炎组与健康对照组唾液中蛋白酶相关分子水平比较 与健康对照组比较，慢性牙周炎组唾液中MMP-1、MMP-8、TIMP-1水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 慢性牙周炎组与健康对照组唾液中蛋白酶相关分子水平比较

2.5慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平与其他指标的相关性 慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平与IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、MMP-1、MMP-8、TIMP-1、PLI、GI、PD、AL呈正相关(P<0.05)，见表4。

表4 慢性牙周炎患者唾液中miR-21水平与其他指标的相关性(n=50)

3 讨 论

慢性牙周炎的发病机制复杂，涉及多因素及多环节，牙周组织在牙菌斑作用下出现炎性反应的过度激活是其基本的病理变化，阐明在牙菌斑促进炎性反应激活过程中的关键分子有助于深入认识慢性牙周炎的发病机制，进而也为探寻新的诊疗靶点提供依据[7]。miR是近年来口腔科领域的研究热点，miR本身不具备编码氨基酸的功能，需要通过与靶基因mRNA结合来改变靶基因表达，进而产生相应的生物学作用。miR-21是一类参与炎性反应调控的miR，但目前关于miR-21在炎性反应中的具体调控作用尚无定论。有研究认为，miR-21通过靶向JNK及TSG4发挥抑炎作用[8-9]；另有研究认为，miR-21通过上调NLRP3及IL-8的表达发挥促炎作用[10-11]。

吴丽娜等[6]以侵袭性牙周炎患者为对象的研究结果显示，侵袭性牙周炎患者的龈沟液中miR-21表达水平明显升高，且与疾病的严重程度相关。本研究结果显示，慢性牙周炎患者唾液中miR-21的表达水平明显升高，提示miR-21表达水平升高与慢性牙周炎的病情加重有关。进一步通过牙周指标的检查来评价慢性牙周炎的病情，发现PLI、GI、PD、AL 4项指标均发生了明显变化，且miR-21的表达水平与4项牙周指标均呈正相关，提示miR-21可能在一定程度上影响了慢性牙周炎的发生、发展，发生这一变化可能与miR-21促进炎性反应激活有关，也可能与miR-21抑制炎性反应，并在牙周炎发生、发展过程中代偿性表达增多有关，但miR-21在慢性牙周炎中起到促炎作用还是抑炎作用，仍需后续细胞或动物实验来验证。

牙周组织在牙菌斑刺激下发生炎性反应的激活是慢性牙周炎基本的病理改变，IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等多种炎性细胞因子在牙周组织炎性反应激活的过程中被大量释放。已有多项研究证实，牙周炎患者龈沟液中上述几种炎性细胞因子的水平明显升高[12-14]，本研究的分析结果与既往研究结果一致。进一步相关性分析发现，慢性牙周炎患者唾液中miR-21的表达水平与IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α的水平呈正相关，说明miR-21表达水平升高可能与炎性细胞因子的释放、炎性反应的激活有关。牙周组织中炎性反应的激活能够使多种炎症细胞在局部浸润，进而释放MMP-1、MMP-8、TIMP-1等蛋白酶及抑制分子并介导牙周组织的水解和破坏[15-17]。本研究结果显示，慢性牙周炎组唾液中MMP-1、MMP-8、TIMP-1的水平升高且与miR-21呈正相关，说明miR-21表达水平升高可能与慢性牙周炎病程中蛋白酶介导的牙周组织破坏有关。

4 结 论

慢性牙周炎患者唾液中miR-21表达水平异常升高，且与牙周指标、炎性细胞因子及蛋白酶分子水平均有一定相关性，提示其可能在慢性牙周炎的发生、发展过程中发挥了一定作用。但是，miR-21在慢性牙周炎中具体发挥促炎还是抑炎的作用有待进一步的细胞实验或动物实验来验证。